Митохондрии связанных ER мембран (MAMS) и гликосфинголипид Обогащенный микродоменов (ГЭУ): Изоляция от мозга мыши
Summary
Эта процедура показывает, как можно изолировать от мозга взрослого человека мышью митохондрий связанных ER мембран или MAMS и гликосфинголипид обогащенного микродоменной фракций из MAMS и митохондриальных препаратов.
Abstract
Внутриклеточных органелл очень динамических структур с различной формой и составом, которые подвергаются клетки конкретных внутренних и внешних сигналов. Их мембраны часто сопоставляется в определенные контакты сайтов, которые становятся центрами для обмена сигнальными молекулами и мембранных компонентов 1,2,3,4. Между органелл мембраны микродоменов, которые образуются между эндоплазматической сети (ER) и митохондрий на открытии IP3 чувствительные Са 2 + каналов известны как митохондрии, связанный-ER мембран или MAMS 4,5,6. Белка / липидного состава и биохимических свойств этих сайтов мембранных контактов были тщательно изучены особенности в отношении их роль в регуляции внутриклеточного Ca 2 + 4,5,6. ER служит в качестве основного магазина внутриклеточного Ca 2 +, и в этом качестве регулирует множество клеточных процессов вниз по течению от Ca 2 + сигнализации, в т.ч.uding посттрансляционных складывающиеся белка и maturation7. Митохондрии, с другой стороны, поддерживать Ca 2 + гомеостаз, путем буферизации цитозольной концентрации Са 2 + предотвращая тем самым начало апоптоза вниз по течению от Ca 2 + 4,8 дисбаланса. Динамичный характер MAMS делает их идеальными сайтов препарировать основных клеточных механизмов, в том числе Ca 2 + сигнализация и регулирование митохондриальных концентрации Са 2 +, биосинтез липидов и транспорта, энергетического метаболизма и выживания клеток 4,9,10,11,12. Несколько протоколов были описаны для очистки этих микродоменов из ткани печени и культивируемых клеток 13,14.
Принимая ранее опубликованных методов во внимание, мы адаптировали протокол для выделения митохондрий и MAMS от взрослого мозга мыши. Для этой процедуры мы добавили дополнительный этап очистки, а именно добыча Triton X100, который электроннойnables изоляции гликосфинголипид обогащенного микродоменной (GEM) доля MAMS. Эти GEM препараты имеют ряд белковых компонентов с кавеол и липидного плоты, полученных от плазматической мембраны или других внутриклеточных мембран, и предложил работать как сборные пункты для кластеризации рецепторных белков и белок-белковых взаимодействий 4,15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Места контакта между внутриклеточных мембран или между органелл и плазматической мембраны клетки представляют динамические сигнализации платформы для основных клеточных процессах. Точную характеристику их функции и состав под обоими физиологических и патологических условиях треб…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы признаем вклад Рената Сано с зачатием начального протокола. Ad'A. держит Ювелиры для детей (JFC) Наделенный кафедры генетики и генной терапии. Эта работа была частично финансируется за счет грантов NIH GM60905, DK52025 и CA021764, и американский ливанских сирийских Associated благотворительности (ALSAC).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Fractionation | |||
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S-5761 | |
| Magnesium Chloride, Hexahydrate | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Calcium Chloride, Dihydrate | Sigma-Aldrich | C-5080 | |
| MAM | |||
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich | M9546-250G | |
| Hepes | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378-250G | |
| BSA, Fraction V, Heat Shock, Lyophilizate | Roche | 03-116-964-001 | |
| Percoll | GE | 17-0891-02 | |
| GEM | |||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500 ml | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Tris Base | Roche | 03-118-142-001 | |
| HCl | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-500 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP166-500 | |
| Common | |||
| Protease Inhibitors Tablets, Complete EDTA-free | Roche | 11-873-580-001 | |
| EQUIPMENT | |||
| 2 ml Douce All-Glass Tissue Grinders | Kimble Chase | 885300-0002 | |
| 15 ml Polypropylene Conical Centrifuge Tubes, BD Falcon | BD | 352097 | |
| 30 ml Round-Bottom Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 45500-30 | |
| 15 ml Round-Bottom Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 45500-15 | |
| Ultracentrifuge tubes, Ultra-Clear, Thinwall, 14×89 mm | Beckman-Coulter | 344059 | |
| Parafilm | Cole-Parmer | PM996 | |
| Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets, 9″ | Fisher Scientific | 13-678-20C |
Referencias
- Poburko, D., Kuo, K. H., Dai, J., Lee, C. H., van Breemen, C. Organellar junctions promote targeted Ca2+ signaling in smooth muscle: why two membranes are better than one. Trends Pharmacol. Sci. 25 (1), 8-15 (2004).
- Pani, B., Ong, H. L., Liu, X., Rauser, K., Ambudkar, I. S., Singh, B. B. Lipid rafts determine clustering of STIM1 in endoplasmic reticulum-plasma membrane junctions and regulation of store-operated Ca2+ entry (SOCE. J. Biol. Chem. 283 (25), 17333-17340 (2008).
- Levine, T., Rabouille, C. Endoplasmic reticulum: one continuous network compartmentalized by extrinsic cues. Curr. Opin. Cell Biol. 17 (4), 362-368 (2005).
- Sano, R., Annunziata, I., Patterson, A., Moshiach, S., Gomero, E., Opferman, J., Forte, M., d’Azzo, A. GM1-ganglioside accumulation at the mitochondria-associated ER membranes links ER stress to Ca(2+)-dependent mitochondrial apoptosis. Mol. Cell. 36 (3), 500-511 (2009).
- Raturi, A., Simmen, T. Where the endoplasmic reticulum and the mitochondrion tie the knot: The mitochondria-associated membrane (MAM). Biochim. Biophys. Acta. , (2012).
- Giorgi, C., De Stefani, D., Bononi, A., Rizzuto, R., Pinton, P. Structural and functional link between the mitochondrial network and the endoplasmic reticulum. Int. J. Biochem. Cell Biol. 41 (10), 1817-1827 (2009).
- d’Azzo, A., Tessitore, R. Sano Gangliosides as apoptotic signals in ER stress response. Cell Death Differ. 13, 404-414 (2006).
- Kroemer, G., Galluzzi, L., Brenner, C. Mitochondrial membrane permeabilization in cell death. Physiol. Rev. 87, 99-163 (2007).
- Rizzuto, R., Brini, M., Murgia, M., Pozzan, T. Microdomains with high Ca2+ close to IP3-sensitive channels that are sensed by neighboring mitochondria. Science. 262, 744-747 (1993).
- Lynes, E. M., Bui, M., Yap, M. C., Benson, M. D., Schneider, B., Ellgaard, L., Berthiaume, L. G., Simmen, T. Palmitoylated TMX and calnexin target to the mitochondria-associated membrane. EMBO J. 31 (2), 457-470 (2011).
- Fujimoto, M., Hayashi, T., Su, T. P. The role of cholesterol in the association of endoplasmic reticulum membranes with mitochondria. Biochem. Biophys. Res. Commun. 417 (1), 635-639 (2012).
- Grimm, S. The ER-mitochondria interface: the social network of cell death. Biochim. Biophys. Acta. 1823 (2), 327-334 (2012).
- Vance, J. E. Phospholipid synthesis in a membrane fraction associated with mitochondria. J. Biol. Chem. 265, 7248-7256 (1990).
- Wieckowski, M. R., Giorgi, C., Lebiedzinska, M., Duszynski, J., Pinton, P. Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells. Nat. Protoc. 4 (11), 1582-1590 (2009).
- Pizzo, P., Viola, A. Lymphocyte lipid rafts: structure and function. Curr. Opin. Immunol. 15 (3), 255-260 (2003).
