Live-cellula Microscopia Video di funghi patogeni fagocitosi
Summary
Si descrivono i metodi per il live-cell microscopia video<em> Candida albicans</emFagocitosi> da parte dei macrofagi. Questi metodi consentono stadio-specifica analisi di migrazione di macrofagi, il riconoscimento, immersione e la maturazione phagosome e rivelare nuovi aspetti della fagocitosi.
Abstract
Liquidazione fagocitaria dei patogeni fungini e microrganismi più in generale, può essere considerato costituito da quattro fasi distinte: (i) la migrazione dei fagociti al sito in cui si trovano i patogeni; (ii) riconoscimento di pattern molecolari associati al patogeno (PAMPs) tramite modello recettori di riconoscimento (PRR), (iii) immersione di microrganismi legati alla membrana cellulare dei fagociti, e (iv) il trattamento delle cellule inghiottito all'interno fagosomi maturazione e la digestione della particella ingerito. Studi che valutano la fagocitosi in toto sono informativi 1, 2, 3, 4, 5, ma sono limitati nel senso che normalmente non rompere il processo di migrazione in giù, immersione e maturazione phagosome, che può essere pregiudicato differenziale. Inoltre, tali studi valutare assorbimento come un singolo evento, piuttosto che come un processo continuo dinamico. Abbiamo recentemente sviluppato avanzate dal vivo di cellule tecnologie di imaging, e hanno unito questi con genetico analisi funzionale di entrambicellule del patogeno e host per creare una piattaforma interdisciplinare per l'analisi della funzione delle cellule immunitarie innate e patogenesi fungina. Questi studi hanno rivelato nuovi aspetti della fagocitosi, che potevano essere osservati con sistematica analisi temporale delle interazioni molecolari e cellulari tra i fagociti umani e agenti patogeni fungini e microrganismi infettivi più in generale. Per esempio, abbiamo cominciato a definire la seguente: (a) i componenti della superficie cellulare per ogni fase del processo di riconoscimento, immersione e l'uccisione delle cellule fungine 1, 6, 7, 8, (b) come geometria della superficie influenza l'efficienza di assorbimento macrofagi e uccisione di lievito e cellule ifali 7, e (c) come engulfment conduce ad alterazioni del ciclo cellulare e il comportamento di macrofagi 9, 10.
In contrasto istantanee singole punto temporale, live-cell video microscopia permette un'ampia varietà di cellule ospiti e patogeni da studiare come cosequenze continua che in periodi di tempo lunghi, fornendo informazioni spaziali e temporali su una vasta gamma di processi dinamici, tra cui la migrazione cellulare, la replica e il traffico vescicolare. Qui si descrive in dettaglio come preparare host e cellule fungine, e per eseguire l'esperimento di video microscopia. Questi metodi possono fornire ad un utente-guida per gli studi futuri con altri fagociti e microrganismi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui il metodo per l'utilizzo di live-cell video microscopia a studiare fagocitosi dei macrofagi è descritto. Microscopia video offre molteplici livelli di informazioni per l'analisi. Un vantaggio fondamentale è che i dati di assorbimento può essere generato (da un singolo esperimento) per ogni punto temporale durante tutto il periodo di osservazione 6 ore. Ancora più importante, il metodo descritto consente analisi differenziale delle singole fasi di fagocitosi. Abbiamo, per esempio, mostrato che le variazioni assorbimento complessivo di C. glicosilazione albicans e mutanti morfogenesi da linee cellulari macrofagiche e macrofagi primari può essere una conseguenza di cambiamenti nella migrazione dei macrofagi verso cellule bersaglio o tasso di immersione una volta contatto cellula-cellula è stabilito 7.
Ci sono una serie di trappole da evitare lo svolgimento questi esperimenti. Primo, è molto importante assicurare condizioni ambientali stabili durante la procedura sperimentaleDure. Ciò si ottiene in una camera ambientale che viene impostato alle condizioni sperimentali diverse ore prima di iniziare l'esperimento. La qualità video è altamente dipendente sofisticati moduli che utilizzano laser a infrarossi per mantenere automaticamente il campione z-posizione indipendentemente cambiamenti meccanici o termici eliminando così la necessità di correzioni fuoco manuale.
Data la natura estesa degli esperimenti, è importante limitare l'esposizione della luce laser e associati effetti photobleaching e fotoconversione, che può essere minimizzata utilizzando marcatori altamente fluorescenti, che facilitano i tempi di esposizione. Il protocollo di colorazione FITC qui descritto è veloce e affidabile. Come FITC è molto luminoso e stabile macchia, tempi di esposizione bassi sono necessari e questo rende ideale FITC per lunghi filmati time-lapse. Tuttavia, abbiamo abitualmente utilizzano una varietà di macchie bersaglio diverse, comprese Calcofluoro bianco e coloranti PKH nonché organismi etichetta.
<p class = "jove_content"> La maggior parte del nostro lavoro pubblicato è condotta utilizzando un ampio campo ottico, ma l'esposizione può essere ulteriormente ridotta utilizzando un microscopio confocale disco che gira nelle nostre mani e questo è essenziale per la microscopia time-lapse video 3D.Durante questo studio, le immagini sono state catturate ad intervalli di 1 minuto per un saggio di fagocitosi 6 ore. L'intervallo tra le immagini può essere regolata a seconda del processo in esame. Per esempio, l'intervallo può essere diminuita quando indagando rapidi processi quali il traffico vescicolare. L'intervallo di tempo minimo sarà limitato dalle specifiche microscopio e della fotocamera. Ci sono alcune considerazioni da tenere a mente durante la regolazione delle temporizzazioni. In primo luogo, riducendo l'intervallo tra le istantanee significa meno punti possono essere esposte e la dimensione del file crescerà considerevolmente. Al contrario, aumentando l'intervallo di immagine troppo farà il film perde continuità.
Questo approccio può essere applicatoin linea di principio per studiare altri agenti patogeni e l'assorbimento di morire cellule ospiti. Per esempio, abbiamo recentemente dimostrato che i macrofagi di midollo osseo derivate da sialoadhesin-carente topo esibiscono notevolmente ridotto vincolante e fagocitosi di sialylated Campylobacter jejuni 8. Tuttavia, le dimensioni di destinazione è un fattore determinante per la fattibilità, come analisi di immagine diventa sempre più difficile con una riduzione delle dimensioni delle cellule bersaglio. Sofisticato software di analisi delle immagini è essenziale per l'analisi rapida microscopia video, e questo dovrebbe essere accompagnato da un adeguato sostegno bioinformatica per facilitare la generazione di algoritmi per studiare la migrazione delle cellule singole e popolazioni di cellule intere 7. Live-cell video microscopia in combinazione con software sofisticati di analisi di immagine per il minuto per minuto l'analisi della migrazione e dei singoli macrofagi-C.albicans interazioni, fornisce una visione unica della complessità di C. fagocitosi albicans da macrophages. C'è un enorme potenziale di espandere questi metodi per studiare altri patogeni e fagociti (cellule dendritiche, i neutrofili) e di sviluppare microscopia video 3D a immagini interazioni cellula-cellula in modo più approfondito o su più superfici fisiologiche come strati di cellule epiteliali ed endoteliali. Questa tecnica fa parte della nuova generazione di strumenti per lo studio di interazioni ospite-patogeno e contribuirà a generare dettagliate informazioni spaziali e temporali su una vasta gamma di processi dinamici.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
LPE è una scozzese Senior Fellow clinica e riconosce il sostegno dell'Ufficio Chief Scientist (SCD/03). Questo lavoro è stato finanziato dal Wellcome Trust Progetto Sovvenzione LPE (089.930). NARG è stato finanziato da un programma Wellcome Trust Grant (080.088) e la sovvenzione di attrezzature (075.470) (per DeltaVision), e da un FP7-2007-2013 Grant (HEALTH-F2-2010-260338-Allfun). Vorremmo ringraziare l'Università di Aberdeen impianto di imaging, in particolare Kevin MacKenzie, per il supporto e consigli utili.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Yeast nitrogen base without amino acids | Formedium | CYN0402 |
| NaOH | Sigma | S5881-500G |
| Adenine hemisulphate salt | Sigma | A3159-25G |
| Agar technical (no. 3) | Oxoid | LP0013 |
| D-glucose | Sigma | G7021-1KG |
| SC-Ura dropout | Formedium | DSCK102 |
| FITC | Sigma | F7250-1G |
| Sodium carbonate | BDH | 301215M |
| Sodium bicarbonate | BDH | 102475W |
| PBS | Gibco | 18912-014 |
| DMEM | Lonza | BE12-614F |
| FCS | Life Technologies | 10106169 |
| Penicillin/streptomycin | PAA | P11-010 |
| L-glutamine | Lonza | BE17-605E |
| LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | L7528 |
| 35 mm glass-dishes | PAA | PAA12305160X |
Referencias
- McKenzie, C. G. J., et al. Contribution of Candida albicans cell wall components to recognition by and escape from murine macrophages. Infect. Immun. 78, 1650-1658 (2010).
- Mora-Montes, H. M., et al. Recognition and blocking of innate immunity cells by Candida albicans chitin. Infect. Immun. 79, 1961-1970 (2011).
- Keppler-Ross, S., et al. Recognition of yeast by murine macrophages requires mannan but not glucan. Eukaryot. Cell. 9, 1776-1787 (2010).
- Vijayan, D., et al. Mincle polarizes human monocyte and neutrophil responses to Candida albicans. Immunol. Cell Biol. , (2012).
- Seider, K., et al. The facultative intracellular pathogen Candida glabrata subverts macrophage cytokine production and phagolysosome maturation. J. Immunol. 187, 3072-3086 (2011).
- Sheth, C., et al. Glycosylation status of the C. albicans cell wall affects the efficiency of neutrophil phagocytosis and killing but not cytokine signalling. Med. Mycol. (5), 513-524 (2011).
- Lewis, L. E. Stage specific assessment of Candida albicans phagocytosis by macrophages identifies cell wall composition and morphogenesis as key determinants. PLoS Pathog. 8 (3), e1002578 (2012).
- Klaas, M., et al. Sialoadhesin Promotes Rapid Proinflammatory and Type I Interferon Responses to a Sialylated Pathogen, Campylobacter jejuni. J. Immunol. , (2012).
- Lewis, L. E., et al. Candida albicans infection inhibits macrophage cell division and proliferation. Fungal Genet. Biol. , (2012).
- Bain, J. M., et al. Non-lytic expulsion/exocytosis of Candida albicans from macrophages. Fungal Genet. Biol. , (2012).
- Mora-Montes, H., et al. Interactions between macrophages and cell wall oligosaccharides of Candida albicans. Methods Mol. Biol. 845, 247-260 (2012).
- McPhillips, K., et al. Assessment of apoptotic cell phagocytosis by macrophages. Methods Mol. Biol. 559, 247-256 (2009).
- Erwig, L. -. P., et al. Differential regulation of phagosome maturation in macrophages and dendritic cells mediated by Rho GTPases and ezrin-radixin-moesin (ERM) proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (34), 12825-12830 (2006).
