Live-cel Video Microscopie van pathogene schimmel Fagocytose
Summary
We beschrijven werkwijzen voor levende cellen videomicroscopie van<em> Candida albicans</em> Fagocytose door macrofagen. Met deze methoden kunt stadium-specifieke analyse van macrofaag migratie, erkenning, afblazen en fagosoom rijping en onthullen nieuwe aspecten van fagocytose.
Abstract
Fagocytische klaring van schimmels en micro-organismen meer in het algemeen worden geacht te bestaan uit vier verschillende fasen: (i) migratie van fagocyten naar de plaats waar ziekteverwekkers zich bevinden; (ii) erkenning van pathogeen geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs) door pattern herkenningsreceptoren (PRRS), (iii) afblazen van micro-organismen gebonden aan het celmembraan fagocyt en (iv) verwerking van overspoeld cellen rijpen in fagosomen en digestie van de opgenomen deeltjes. Studies die fagocytose beoordelen in zijn geheel informatief 1, 2, 3, 4, 5 maar zijn beperkt omdat zij normaal niet het proces af te breken in migratie afblazen en fagosoom rijping, die verschillend kunnen worden beïnvloed. Bovendien zijn dergelijke studies beoordelen opname als een enkele gebeurtenis, niet als een continu dynamisch proces. We hebben recent ontwikkelde geavanceerde live-cell imaging technologieën, en hebben samen deze met genetische functionele analyse van zowelpathogeen en gastheer cellen om een cross-disciplinair platform voor de analyse van aangeboren immuunsysteem cel functie en schimmel pathogenese te creëren. Deze studies hebben aangetoond vernieuwende aspecten van fagocytose die alleen kunnen worden waargenomen met behulp van systematische temporele analyse van de moleculaire en cellulaire interacties tussen menselijke fagocyten en schimmels en besmettelijke micro-organismen meer in het algemeen. Zo zijn we begonnen voor het volgende: (a) de bestanddelen van het celoppervlak voor elke fase van het proces van herkenning, afblazen en doden van schimmelcellen 1, 6, 7, 8, (b) hoe oppervlaktegeometrie beïnvloedt de efficiency van macrofaag opname en doden van gist en hyphale cellen 7, en (c) hoe engulfment leidt tot wijziging van de celcyclus en het gedrag van macrofagen 9, 10.
In tegenstelling tot enkel tijdstip snapshots, levende cellen videomicroscopie maakt een grote verscheidenheid van gastheercellen en pathogenen worden bestudeerd continu sequenties over langere perioden, het verstrekken van ruimtelijke en temporele informatie over een breed scala aan dynamische processen, met inbegrip van celmigratie, replicatie en vesiculair transport. Hier beschrijven we in detail hoe u gastheer en schimmelcellen voor te bereiden, en om de video microscopie experimenten uit te voeren. Deze methoden kunnen een door de gebruiker gids voor toekomstige studies met andere fagocyten en micro-organismen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier de werkwijze voor het gebruik van levende cellen videomicroscopie om macrofaag fagocytose studie beschreven. Video microscopie biedt meerdere extra lagen met informatie voor analyse. Een belangrijkste voordeel is dat de opname gegevens kunnen worden verkregen (van een experiment) voor elk tijdstip gedurende de 6 uur observatieperiode. Belangrijker beschreven werkwijze maakt differentiële analyse van de verschillende fasen van fagocytose. We hebben bijvoorbeeld aangetoond dat veranderingen in de totale opname van C. albicans glycosylering en morfogenese mutanten door macrofaag cellijnen en primaire macrofagen kan een gevolg zijn van veranderingen in de macrofaag migratie naar doelcellen of de snelheid van afblazen eenmaal cel-cel contact is gevestigd 7 is vastgesteld.
Er zijn een aantal valkuilen bij het uitvoeren van deze experimenten. Ten eerste is het zeer belangrijk om stabiele omgevingsomstandigheden in de gehele experimentele procedure. Dit wordt het best bereikt in een klimaatkamer die is ingesteld op de experimentele omstandigheden enkele uren voordat het experiment. Video kwaliteit is sterk afhankelijk van geavanceerde modules die infrarode lasers gebruiken om automatisch onderhouden sample z-positie, ongeacht mechanische of thermische veranderingen waardoor de noodzaak voor handmatige correcties.
Gezien de aard van de uitgebreide experimenten is belangrijk te beperken blootstelling aan laserlicht en bijbehorende fotobleken en fotoconversie effecten die kunnen worden geminimaliseerd door hoog fluorescente markers die laag belichtingstijden vergemakkelijken. De FITC kleuringsprotocol hier beschreven is snel en betrouwbaar. Als FITC is een zeer lichte en stabiele vlek, lage belichtingstijden nodig zijn en dit maakt FITC ideaal voor langere time-lapse filmpjes. Maar we routinematig gebruik van een verscheidenheid van verschillende doel vlekken, waaronder Calcofluor White en PKH kleurstoffen en gelabeld organismen.
<p class = "jove_content"> De meeste van onze gepubliceerde werk wordt uitgevoerd met behulp van een wide-field microscoop, maar de blootstelling kan verder geminimaliseerd worden door gebruik te maken van een draaiende schijf confocale microscoop en in onze handen is van essentieel belang voor time-lapse 3D-video microscopie.Tijdens dit onderzoek werden beelden opgenomen met een min tussenpozen gedurende 6 uur fagocytose assay. Het interval tussen afbeeldingen kunnen worden aangepast afhankelijk van de werkwijze onderzocht. Bijvoorbeeld kan het interval verlaagd bij het onderzoek snel processen zoals vesiculair transport. De minimale tijdsinterval zal worden beperkt door microscoop en camera specificaties. Er zijn een aantal overwegingen in gedachten te houden bij het aanpassen van timings. Ten eerste, zal het verminderen van de interval tussen snapshots betekent minder punten kunnen worden afgebeeld en de bestandsgrootte zal flink worden verlengd. Integendeel, zal het verhogen van de beeld-interval te veel make van de film verliest continuïteit.
Deze benadering kan worden toegepastin principe aan andere pathogenen en opname van stervende gastheer cellen te bestuderen. Zo hebben we onlangs aangetoond dat beenmerg afgeleide macrofagen van sialoadhesine-deficiënte muizen vertonen sterk verlaagde binding en fagocytose van gesialyleerde Campylobacter jejuni 8. Echter, beoogde omvang is een belangrijke determinant voor de haalbaarheid, zoals beeldanalyse wordt het steeds moeilijker met een vermindering van de doelcel grootte. Geavanceerde beeldanalyse software is essentieel voor een snelle videomicroscopie analyse en dient gepaard met geschikte bio steun voor de generatie van algoritmen migratie van individuele cellen en gehele celpopulaties 7 studieprestaties. Live-cell microscopie video in combinatie met geavanceerde beeldanalyse-software voor de minuut tot minuut analyse van migratie en individuele macrofaag-C.albicans interacties, geeft uniek inzicht in de complexiteit van C. albicans fagocytose door macrophages. Er een enorm potentieel om deze werkwijzen uit te breiden naar andere pathogenen en fagocyten (dendritische cellen, neutrofielen) bestuderen en 3D videomicroscopie ontwikkelen image cel-cel interacties nader of meer fysiologische oppervlakken zoals epitheliale en endotheliale cellagen. Deze techniek maakt deel uit van de volgende generatie hulpmiddelen in de studie van gastheer-pathogeen interacties en zal helpen bij het genereren gedetailleerde ruimtelijke en temporele informatie over een breed scala van dynamische processen.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
LPE is een Schotse Senior Clinical Fellow en erkent de steun van de Chief Scientist Office (SCD/03). Dit werk werd gefinancierd door Wellcome Trust Project Grant aan LPE (089.930). NARG werd gefinancierd door een Wellcome Trust Programme Grant (080088) en een uitrusting Grant (075.470) (voor DeltaVision), en door een FP7-2007 tot +2.013 Grant (GEZONDHEID-F2-2.010 tot 260.338-Allfun). We willen de Universiteit van Aberdeen imaging faciliteit, in het bijzonder Kevin MacKenzie, dank voor nuttige ondersteuning en advies.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Yeast nitrogen base without amino acids | Formedium | CYN0402 |
| NaOH | Sigma | S5881-500G |
| Adenine hemisulphate salt | Sigma | A3159-25G |
| Agar technical (no. 3) | Oxoid | LP0013 |
| D-glucose | Sigma | G7021-1KG |
| SC-Ura dropout | Formedium | DSCK102 |
| FITC | Sigma | F7250-1G |
| Sodium carbonate | BDH | 301215M |
| Sodium bicarbonate | BDH | 102475W |
| PBS | Gibco | 18912-014 |
| DMEM | Lonza | BE12-614F |
| FCS | Life Technologies | 10106169 |
| Penicillin/streptomycin | PAA | P11-010 |
| L-glutamine | Lonza | BE17-605E |
| LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | L7528 |
| 35 mm glass-dishes | PAA | PAA12305160X |
Referencias
- McKenzie, C. G. J., et al. Contribution of Candida albicans cell wall components to recognition by and escape from murine macrophages. Infect. Immun. 78, 1650-1658 (2010).
- Mora-Montes, H. M., et al. Recognition and blocking of innate immunity cells by Candida albicans chitin. Infect. Immun. 79, 1961-1970 (2011).
- Keppler-Ross, S., et al. Recognition of yeast by murine macrophages requires mannan but not glucan. Eukaryot. Cell. 9, 1776-1787 (2010).
- Vijayan, D., et al. Mincle polarizes human monocyte and neutrophil responses to Candida albicans. Immunol. Cell Biol. , (2012).
- Seider, K., et al. The facultative intracellular pathogen Candida glabrata subverts macrophage cytokine production and phagolysosome maturation. J. Immunol. 187, 3072-3086 (2011).
- Sheth, C., et al. Glycosylation status of the C. albicans cell wall affects the efficiency of neutrophil phagocytosis and killing but not cytokine signalling. Med. Mycol. (5), 513-524 (2011).
- Lewis, L. E. Stage specific assessment of Candida albicans phagocytosis by macrophages identifies cell wall composition and morphogenesis as key determinants. PLoS Pathog. 8 (3), e1002578 (2012).
- Klaas, M., et al. Sialoadhesin Promotes Rapid Proinflammatory and Type I Interferon Responses to a Sialylated Pathogen, Campylobacter jejuni. J. Immunol. , (2012).
- Lewis, L. E., et al. Candida albicans infection inhibits macrophage cell division and proliferation. Fungal Genet. Biol. , (2012).
- Bain, J. M., et al. Non-lytic expulsion/exocytosis of Candida albicans from macrophages. Fungal Genet. Biol. , (2012).
- Mora-Montes, H., et al. Interactions between macrophages and cell wall oligosaccharides of Candida albicans. Methods Mol. Biol. 845, 247-260 (2012).
- McPhillips, K., et al. Assessment of apoptotic cell phagocytosis by macrophages. Methods Mol. Biol. 559, 247-256 (2009).
- Erwig, L. -. P., et al. Differential regulation of phagosome maturation in macrophages and dendritic cells mediated by Rho GTPases and ezrin-radixin-moesin (ERM) proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (34), 12825-12830 (2006).
