JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biología

Biochimica e High Throughput valutazione microscopica di massa grassa in<em> Caenorhabditis Elegans</em

Published: March 30, 2013
doi:
10.3791/50180
, , ,
1Center for Human Genetic Research and Department of Medicine,Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School, 2Department of Earth, Atmospheric, and Planetary Sciences,Massachusetts Institute of Technology

Summary

Vi presentiamo robusti metodi biochimici e microscopiche per lo studio<em> Caenorhabditis elegans</em> Depositi lipidici. Un rapido, semplice, fissando-procedura di colorazione per l'imaging fluorescente goccia lipidica sfrutta le proprietà spettrali del colorante lipofilo rosso Nilo. Abbiamo poi presentare misurazione biochimica di trigliceridi e fosfolipidi mediante estrazione in fase solida e gas cromatografia-spettrometria di massa.

Abstract

Il nematode C. elegans è emerso come un importante modello per lo studio delle vie genetiche conservate che regolano il metabolismo dei grassi in cui riguarda l'obesità umana e le sue patologie associate. Diverse metodologie precedenti sviluppate per la visualizzazione di C. elegans depositi grassi ricche di trigliceridi hanno dimostrato di essere erronea, evidenziando compartimenti cellulari diversi goccioline lipidiche. Altri metodi richiedono attrezzature specializzate, sono in termini di tempo, o dare risultati non coerenti. Si introduce una rapida, riproducibile, fissativo basata Nilo metodo di colorazione rossa per la rivelazione precisa e rapida di goccioline lipidiche neutre in C. elegans. Un passo fissazione breve nel 40% isopropanolo rende animali completamente permeabili al rosso Nilo, che viene quindi utilizzato per colorare animali. Proprietà spettrali del colorante lipofilo lasciarlo fortemente e selettivamente nella fluorescenza giallo-verde dello spettro solo quando in un ambiente ricco di lipidi, ma non in piùambienti polari. Così, goccioline lipidiche possono essere visualizzati su un microscopio a fluorescenza equipaggiato con semplici funzionalità di imaging GFP dopo solo una breve fase di colorazione rosso Nilo in isopropanolo. La velocità, convenienza, e la riproducibilità di questo protocollo lo rendono ideale per gli schermi ad alto rendimento. Abbiamo inoltre dimostrato un metodo associato per la determinazione biochimica di trigliceridi e fosfolipidi mediante gascromatografia-spettrometria di massa. Questo protocollo più rigorosa dovrebbe essere utilizzato come conferma dei risultati ottenuti dalla determinazione lipidico rosso Nilo microscopica. Prevediamo che queste tecniche diventeranno nuovi standard nel campo della C. elegans ricerca metabolica.

Introduction

Conservazione delle vie metaboliche tra gli esseri umani e le nematode Caenorhabditis elegans lo rende un organismo modello potente per lo studio dell'obesità. Mentre C. elegans non hanno adipociti dedicati al deposito di grasso, come nei mammiferi, che fanno negozio di trigliceridi in gocce lipidiche 1 e presentano molte delle stesse autorità di regolamentazione del deposito di grasso e di energia 2,3. Per test per i livelli di grasso nel C. elegans, diversi metodi sono stati proposti con diversi livelli di facilità e successo. L'uso comune di una volta fluorescenti, coloranti vitali 4-7 è stata recentemente messa in discussione, e questi reagenti dimostrato di essere la colorazione un vano distinto dal deposito principale deposito di grasso di C. elegans 1,8-11. Fissativo a base di coloranti non fluorescenti, come il Sudan nero e olio-rosso-O, mentre il successo a mettere in luce gocce lipidiche nel verme 12-14, non hanno la più ampia gamma dinamica per la quantificazione come fluorescenticent coloranti 8,13,15. Inoltre, gli attuali metodi di fissazione di coloranti fluorescenti e sia non fluorescente sono lunghe e comportano molteplici passaggi di congelamento-scongelamento e / o l'uso di sostanze chimiche tossiche 1,9,10. L'uso di specifici analoghi lipidici BODIPY-etichettati è stato riportato per evidenziare goccioline lipidiche se somministrate a vivere con vermi breve termine etichettatura 15. Tuttavia questo si basa sulla captazione del colorante ed è quindi polarizzato da C. elegans manipolazione e metabolismo di BODIPY analoghi di acidi grassi. Un'alternativa istituito per lipidi colorazione coloranti è privo di etichetta, coerente anti-Stokes scattering Raman (CARS) o stimolato scattering Raman (SRS) microscopia, che sfruttano le proprietà caratteristiche vibrazionali delle molecole lipidiche per visualizzare le riserve di grasso 10,16, 17. Tuttavia, costose attrezzature specializzate è necessario per questo metodo, e la produttività è bassa al meglio.

Per soddisfare la necessità di una rapida, analisi scalabilesis di negozi lipidi neutri in C. ricerca elegans metabolica, si introduce un nuovo metodo altamente riproducibile di fissativo a base di lipidi colorazione rossa del Nilo. Proprietà spettrali e fisico-chimiche del colorante lipofilo rosso Nilo indurre un giallo-oro spettrale spostamento nella sua eccitazione-picco di emissione, permettendo di fluorescenza nello spettro di emissione verde solo quando in un ambiente ricco di lipidi, ma non in ambienti più polari 18 , 19. Così goccioline lipidiche può essere rilevata dopo colorazione semplice grazie all'impiego di una proteina verde fluorescente (GFP) filtro impostata per microscopia a fluorescenza. La facilità e la convenienza di questa tecnica lo rendono ideale per gli schermi ad alto rendimento. Abbiamo anche dare prova di una coppia, metodo rigoroso per la determinazione biochimica dei trigliceridi e fosfolipidi mediante estrazione in fase solida e gas cromatografia-spettrometria di massa. Misurazione lipidico biochimica correla con rosso Nilo basata determinazione microscopica di C. elegans famassa t, e dovrebbe essere usato come una conferma risultanze con determinazione lipidi microscopica.

Protocol

1. Preparazione del Rettangolare Amp / Tet (A / T) piastre di agar LB e NGM IPTG Piastre RNAi A piastre / T deve essere preparato 1-4 settimane prima dell'uso e conservate al buio a 4 ° C. Per 1 L di supporto aggiungere 1 L di acqua deionizzata, 32 g di agar LB, 1,5 ml di NaOH 2 M, e 2 g di agar Bacto. Autoclave 40 min sul ciclo liquido. Dopo raffreddamento a 60 ° C, aggiungere 3 ml di tetraciclina e 0,5 ml ampicillina. Versare 45 ml di mezzo in ciascuna piastra. Preparare 96 pozzetti RNAi 3 giorni fino a 2 settimane di anticipo. Versare 25 piastre da 96 pozzetti RNAi, preparare 1 L di crescita supporti nematode (NGM): 1 L di acqua deionizzata, 3 g di NaCl, 17 g di agarosio, e 2,5 g bactopeptone. Autoclave a ciclo liquido a 121 ° C per 40 min con una ancoretta. Lasciate raffreddare, mescolando su un set piastra calda a 60 ° C. Lasciar raffreddare a 60 ° C, aggiungere le seguenti soluzioni di archivi: 1 ml 1 M MgSO4, 1 ml 5 mg / ml di colesterolo, 25 ml 1 M KH 2 </sub> PO 4 (pH 6.0), 1 ml 1 M CaCl 2, 1 ml 200 mg / ml carbenicillina, e 5 ml 1 M IPTG (vedi tabella Materiali per ricette). Dispensare 150 ml di RNAi mezzi di comunicazione in ogni pozzetto di un fondo piatto piastra a 96 pozzetti utilizzando una pipetta multicanale elettronica. Evitare bolle d'aria. Conservare i supporti in un recipiente sterile acciaio inossidabile immerso in un bagno di acqua 60 ° C durante la distribuzione. Mantenere RNAi livello piastre fino agarosio solidifica. Le piastre possono essere versata fino a 2 settimane in anticipo e conservati a 4 ° C. Giorno 1 2. Timbro Piatti Biblioteca congelati su Rettangolare Amp / Tet (A / T) piastre di agar LB A Warm piatti / T a temperatura ambiente, tenendoli al buio. Trasferimento di piastre a 96 pozzetti biblioteca RNAi da -80 ° C in ghiaccio secco. Aprire la piastra di alluminio sigillato nei pressi di un becco Bunsen. Sterilizzare a 96 pin replicatore immergendo perni serie (10 secondi ciascuno) in candeggina al 10%, H 2 O deionizzata, e il 70% ETOH seguita passando perni attraverso una fiamma. Ripetere EtOH e passo fiamma. Applicare replicatore a quelle congelate 96 pozzetti stock in glicerolo RNAi, assicurandosi che ogni pin contatto con la superficie di ciascun pozzetto. Timbro su un piatto / T, disegnando un piccolo cerchio con ogni pin senza danneggiare superficie dell'agar. Re-tenuta e la biblioteca di ritorno piastre a -80 ° C. Incubare le piastre timbrata A / T a 37 ° C per una notte per la crescita batterica. Giorno 2 3. Grow cloni RNAi batteriche Pernottamento in Deep-e blocchi Rimuovere le piastre A / T di 37 ° C e confermare la crescita batterica. Riempire ogni pozzetto di un blocco a 96 pozzetti profondi bene con 1,5 ml di LB con 200 pg / ml carbenicillina. Sterilizzare 96-pin replicatore (vedi punto 2.3). Applicare replicatore all'inizio della piastra A / T, rendendo sugli sicuro prendere contatto con ciascun clone batterico RNAi. Sollevare replicatore e perni immergere nel profondo pozzo-blocco. Swirl, e rimuovere lentamente, rendendo certain non contaminare i pozzi adiacenti. Sigillare blocco con-facile respirare film. Incubare per una notte a 37 ° C con agitazione (950 rpm in MT Infors Microtiteron II shaker, preferito, o 250 giri in 25 mm tiro agitazione incubatore). Giorno 3 4. Seed cloni RNAi batterica su 96 pozzetti NGM Piastre RNAi Rimuovere piastre a 96 pozzetti RNAi da 4 ° C e portarlo a temperatura ambiente. Rimuovere profondi e blocchi e centrifugare 10 minuti a 4000 x g. Rapidamente invertire i blocchi nel lavandino per drenare i media, e timbro invertita su un tovagliolo di carta per eliminare i supporti in eccesso. Sotto cappa a flusso laminare, aggiungere 40 ml di LB con 200 pg / ml carbenicillina a ciascun pozzetto e chiudere con pellicola sterile. Ritorno blocchi a temperatura ambiente batterica shaker per 10 minuti per risospendere pellet, o manualmente risospendere pellet pipettando attento. Nella cappa a flusso laminare, rimuovere la pellicola di trasferimento sterile e batteri da deep-blocchi e su piastre da 96 pozzetti RNAi. Aggiungere 40 ml di batteri risospeso a righe 'A' e 'H', e 35 microlitri di tutte le altre righe. Più liquido viene aggiunto ai pozzetti di bordo della piastra a 96 pozzetti RNAi per evitare secchino troppo e screpolature della agarosio. Lasciare asciugare le piastre scoperte in cappa per 4-6 ore, controllando regolarmente per secchezza. Batteri secco apparire chiaro, non nuvoloso. Coprire, capovolgere le piastre e incubare a temperatura ambiente per una notte. 5. Preparare una popolazione sincrono di Worms Due piastre 10 centimetri riempito con molti vermi gravide sono utilizzati per la preparazione uovo per ogni 6 piastre da 96 pozzetti RNAi. Assicurarsi che i vermi non sono morti di fame per almeno due generazioni (7 giorni). Preparare una popolazione sincrona di L1 come precedentemente descritto 20. Per 20 ml di soluzione di candeggina, candeggina usare 4 ml, 1 ml di NaOH (10 M), 5 ml di H 2 O deionizzata, e 10 ml di M9 tampone. Sincronizzare vermi durante la notte in 10 ml M9 in 15 ml steriletubo di polipropilene con rotazione a 20 ° C. Giorno 4 6. Aggiungi a Worms Piatti RNAi Centrifugare prepara uova a 3000 xg per 1 min. Aspirare il surnatante, rimanendo lontano dal pellet di larve L1. Risospendere in 5 ml di tampone M9 con 0,0005% Triton X-100. Aggiunta della piccola quantità di detersivo vermi impedisce di attaccarsi alla pipetta e non ha effetto sulla colorazione grasso. Contare i vermi al microscopio. Se necessario, regolare la concentrazione a 10-15 vermi per microlitro. Nella cappa a flusso laminare, per ciascuna piastra da 96 pozzetti ad essere seminato, aggiungere 75 ml di vermi risospeso in ciascun pozzetto di una riga di un blocco poco profondo-bene dosaggio. Usando una pipetta multicanale manuale, aggiungere 50-75 vermi in 5 pl in ogni pozzetto delle piastre da 96 pozzetti RNAi. Permettono piastre asciugare nella cappa per 30 a 60 min. Una volta asciutta, sotto un microscopio, i vermi che vi sembra essere strisciare, non botte. Grow vermi nei piatti RNAia 20 ° C per ~ 64 hr. 7 ° giorno 7. Fissare e Stain Worms nel Nile Red Togliere le piastre di RNAi da incubatrice. Esaminare al microscopio e registrare affamato o botte (bagnato) pozzi di escludere da ulteriori analisi, come queste condizioni influenzano la massa grassa. Utilizzando un pipettatore elettronico ripetizione, aggiungere 150 microlitri di PBS con 0,01% di triton X-100 in ciascun pozzetto di una piastra RNAi. Con un manuale pipettatore multicanale, mescolare e liquido di trasferimento con i vermi alla riga corrispondente a 96-deep-pozzetti PCR. Evitare di interrompere l'agar. Ripetere l'operazione per un totale di 300 vermi pl in PBS per pozzetto. Quando le piastre quattro sono stati trasferiti, centrifugare le piastre a 500 rpm per 1 min. Aspirare il surnatante utilizzando un 96-pin aspiratore, lasciando ~ 25 microlitri di liquido e verme pellet sul fondo del pozzo. Aggiungere 150 pl di 40% isopropanolo a ciascun pozzetto per fissare animali. Accertarsi che la pipetta è una velocità sufficientemente alta da miscelare vermepellet con il 40% di isopropanolo. Incubare a temperatura ambiente per 3 min. Piastre centrifugare scoperto a 500 rpm per 1 min. Aspirare il surnatante utilizzando un 96-pin aspiratore o manualmente, lasciando solo 25 pl + 40% di isopropanolo verme pellet sul fondo del pozzo. A ciascun pozzetto, aggiungere 150 microlitri di soluzione di colorazione del Nilo rosso preparata immediatamente prima dell'uso: 6 ul di soluzione rosso Nilo magazzino di 0,5 mg / ml in acetone per 1 ml di 40% di isopropanolo. Sigillare la piastra con non sterile pellicola adesiva e macchia al buio per almeno 2 ore. 8. Worms Lavare e immagine su un High-throughput Microscopio Centrifugare a 500 rpm per 1 min e aspirare tutto ma 25 pl di colorante rosso Nilo. Aggiungere 150 pl di PBS con 0,01% di triton X-100 in ciascun pozzetto e conservare al buio per almeno 30 min. Centrifugare a 500 rpm per 1 min. Utilizzando un 12 canali pipettatore, animali aspirato dal fondo di ciascun pozzetto con 2 x 7 quick microlitriictus e dispensare su un 96-ben-Teflon stampato vetrino. Con cura, senza la rimozione dei worm, rimuovere 9,5 ml di PBS da ciascun pozzetto del vetrino. Se il vetrino non entra direttamente in supporto microscopio, una consuetudine lavorato portavetrini in alluminio deve essere usato per montare i vermi. Coperchio scorrevole Abbassare lentamente su un vetrino da 96 pozzetti. Questo passaggio può richiedere una certa pratica per evitare bolle o attraversare di vermi in altri pozzi. Angoli sicuri con tack adesivo. Diapositiva immagine in campo chiaro e fluorescenza con un GFP / FITC filtro impostato su un microscopio automatizzato. I lipidi photobleaches segnale facilmente e quindi dovrebbe essere ripreso in modo sistematico in tutti i pozzetti, non manualmente, come photobleaching porterà a differenze artificiali tra pozzi. Per maggiori dettagli sulle analisi, vedere Rappresentante dei risultati e discussione. 9. Lipidi Determinazione biochimica Uso estrazione in fase solida (SPE) e la gas cromatografia-spettrometria di massa (GC / MS) <p class="Jove_content"> Per la convalida dei livelli lipidici basato su Nile fluorescenza rossa, gas cromatografia seguita da spettrometria di massa (GC / MS) può essere eseguita su esteri metilici di acidi grassi (FAME) derivati ​​da triacilgliceroli (TAG) e fosfolipidi (PL) da a vite senza fine pellet. Passi che coinvolgono organici deve essere effettuata sotto una cappa aspirante. Si deve prestare attenzione che i lipidi sono tenuti sotto azoto al riparo dalla luce durante la conservazione prolungata o le fasi di incubazione in quanto sono molto vulnerabili all'ossidazione. Pellet di vite senza fine di 2.500-5.000 animali sincroni sono utilizzati come input, preparata esattamente come sopra, tranne che gli animali sono coltivati ​​su 10 cm piatti RNAi. Lavare 2.500-5.000 vermi di ogni piatto cm 10 con 10 ml di tampone M9 in un tubo da 15 ml conica in polipropilene. Vermi pellet a 500 xg per un minuto, e lavare pellet nuovamente con 10 ml di tampone M9. Animali a pellet a 500 x g. Aspirare lasciando 250 microlitri di volume totale, e sia congelamento azoto liquido e conservare a -80 ° C sotto azoto for la successiva elaborazione o procedere direttamente. Il worm pellet può essere preso direttamente al punto 9.3 Se la massa dei trigliceridi deve essere normalizzato a massa fosfolipidi 8,13,21. Tuttavia, se il ricercatore desidera normalizzazione al contenuto proteico o contenuto di DNA, il verme pellet dovrebbe essere sonicato sulla massima intensità in un bagno sonicatore per 10 min, 30 sec on, off 30 sec, a 4 ° C. Se la normalizzazione proteine ​​o DNA è desiderato, rimuovere Un'aliquota di 5 microlitri e determinare la concentrazione totale di proteine ​​utilizzando un reagente di Bradford o contenuto di DNA simili o totale dopo purificazione colonna utilizzando uno spettrofotometro UV. Aggiungi vermi a 1,5 ml 02:01 cloroformio: metanolo in un tubo filettato in vetro borosilicato. Tutti i trasferimenti di solventi organici dovrebbe essere fatto utilizzando pipette di vetro. Utilizzando una pipetta wiretrol 50 microlitri, aggiungere 25 standard fosfolipide nM in 50 microlitri, e 16,7 nM standard di trigliceridi in 50 microlitri. Entrambi gli standard deve essere sciolto in 2:1 cloroformio: metanolo, ricoperto ermeticamente,e conservato sotto azoto protetto dalla luce in un freezer a -80 ° C per evitare l'ossidazione. Cap con cappuccio fenolica e vortice. Estratto per 1 ora a temperatura ambiente, vortex ogni 15 min. Centrifugare a 1000 rpm per 5 min. Trasferire fase inferiore organica senza carcasse ad un tubo borosilicato cultura. Aggiungere 0,3 ml 0,9% NaCl, vortex e centrifugare a 1000 rpm per 5 min. Trasferimento strato organico inferiore in una nuova provetta cultura borosilicato, facendo attenzione a non trasferire su qualsiasi della fase acquosa. Asciutto fase organica sotto azoto. Per iniziare l'estrazione in fase solida (SPE) risospendere lipidi essiccati in 1 ml di cloroformio. In alternativa, per la separazione e l'analisi dettagliata delle classi lipidiche distinte, comprese le classi fosfolipidiche, glicolipidi, sfingolipidi, diacilgliceroli, trigliceridi, acidi grassi liberi, colesterolo ed esteri, cromatografia su strato sottile, come sperimentato dal laboratorio Watts in C. elegans 22 può essere usato al posto di SPE. I lipidi possono anche be separati mediante HPLC e frazioni analizzati da GCMS. Metodi sofisticati di tutto il lipidome profili da liquid-chromatography/MS (LCMS) può essere utilizzato anche 23-26. Assemblare SPE colonna di silice sul collettore SPE. Pre-equilibrare colonna con 3 ml di cloroformio. Permettono solvente di fluire per gravità. Caricare campione lipidico sulla colonna SPE, raccogliendo flusso in un tubo filettato borosilicato come parte della prima frazione (frazione TAG). La maggior parte dei lipidi neutri verrà attraverso in questa prima 1 ml a flusso continuo. Aggiungere 3 ml di cloroformio per eluire completamente frazione TAG, la raccolta a flusso continuo nel tubo frazione TAG. Rimuovere e tappare il primo tubo di raccolta, e sostituirlo con un tubo di raccolta pulita. Glicosfingolipidi eluire con 5 ml di acetone 09:01: metanolo. Non routine analizzare la composizione in acidi grassi di questa frazione, tuttavia, può contenere informazioni preziose e possono essere salvati per la preparazione di esteri metilici e basi sfingoidi liberi per ulteriori analisi utilizzandoprocedure specializzate distinti da quelli per TAG e PL come precedentemente descritto 27. Sostituire il tubo di raccolta glicosfingolipidi con un secondo tubo filettato raccolta borosilicato. Eluire fosfolipidi con 3 ml di metanolo (frazione PL). Le frazioni possono essere conservati a -80 ° C, a questo punto ricoperto ermeticamente sotto azoto. Secco purificato lipidi sotto azoto. Per accelerare l'essiccazione, in un blocco di riscaldamento a secco a 33 ° C. Non conservare mai i lipidi in forma essiccata, in quanto sono particolarmente sensibili all'ossidazione allo stato essiccato. Risospendere le frazioni lipidiche secchi in 2 ml 2% H 2 SO 4 in metanolo nel vortex e incubare ricoperto ermeticamente durante la notte in un 55 C ° bagno di acqua per creare FAME. Si deve prestare attenzione per ottenere assolutamente niente acqua nella reazione FAME come questo sarà di grande inibire derivatizzazione dei lipidi. Abbiamo trovato derivatizzazione più efficiente incubazione durante la notte e la letteratura suggerisce l'ossidazione dei lipidi meno avviene a temperature più basse during FAME preparazione 28. Un metodo alternativo e più rapido è usare 2 ml 2,5% H 2 SO 4 in metanolo e derivatizzare per un'ora a 70 o 80 ° C 21,22,29. La mattina seguente, togliere dal bagno, e lasciar raffreddare. Aggiungere 1,5 ml di H 2 O (per estinguere la reazione) e quindi 0,3 ml di esano (per estrarre i FAMEs) per ciascuna frazione TAG e PL. Agitare vigorosamente e centrifugare a 1000 rpm per 5 min. Con molta attenzione rimuovere solo strato superiore esano attraverso uno standard di pipetta o pipetta Pasteur. Versare nel tubo campionatore automatico. Accertarsi di non inserire alcun metanolo acidificato come questo distruggerà la colonna GC e MSD. Cap e campioni di carico su GC / MS. Il campione viene trasferito in esano ad una micro-inserto vial Agilent tappata con un PTFE-silicone-PTFE tappo a vite. È trasferito al 6890/5973N Agilent modello GCMS dotato di un Supelcowax-10 (24.079) 30 metri, 250 colonna capillare di silice fusa micron. Un microlitro viene iniettato intingresso OA splitless impostata a 250 ° C e 13,33 PSI ultrapura elio viene utilizzato un gas vettore. L'esecuzione del protocollo è il seguente: ad una costante 1 ml per minuto: Passo Istruzione Obiettivo della temperatura 1 Tenere 2 min 150 ° C 2 Rampa 10 ° C per min 200 ° C 3 Tenere 4 min 200 ° C 4 Rampa di 5 ° C al minuto 240 ° C 5 Tenere 3 min 240 ° C 6 Rampa 10 ° C per min 270 ° C 7 Tenere 5 min 270 ° C Un ritardo di 3 min solvente è usato al MSD per minimizzare l'usura sul filAment. Successivamente, masse tra 50 e 550 Daltons vengono rilevati con il set quadruple MS a 150 ° C e la fonte ms impostato a 230 ° C, con una temperatura termico ausiliario di 270 ° C.

Representative Results

Un esempio di una lastra esposta che è stata presa attraverso il workflow colorazione grasso è mostrato in Figura 1. Controlli specifici per alto contenuto di grassi (daf-2 recettore dell'insulina RNAi), basso contenuto di grassi (lpd-3 proteina necessaria per granuli di stoccaggio dei lipidi nell'intestino RNAi), piccolo e basso di grassi (FASN-1 acido grasso sintasi RNAi), e il vettore vuoto ( controllo) mostrano le variazioni di intensità di fluorescenza secondo i livelli di grassi degli animali, e gli importi lipidi corrispondenti determinati mediante GC / MS (Figura 2). Si noti che inattivazioni geni che portano alla evolutivi arrestato, piccoli animali spesso sembrano avere molto più basso di grassi animali di controllo adulti, indipendentemente da qualsiasi collegamento con il metabolismo dei grassi (Figura 3). Analisi secondarie, tra cui l'analisi di colorazione e biochimica dei lipidi con SPE-GCMS di wild-type animali di controllo di un equivalente stadio di sviluppo deve essere fatto per garantire la validità deipiccolo o evolutivamente arrestato risultati positivi. Nel caso di fasn-1 RNAi (Figura 2), arresto animali sia nella L2 o L3 stadio larvale, e presentano macchie di grasso inferiore controllo RNAi adulto, ma simile in abbondanza di L2-L3 stadio di controllo (grassi animali RNAi cento macchia adulto di controllo RNAi: 49.9 ± 4.5% per FASN-1 RNAi e 20,2 ± 2,1% per il controllo L2 RNAi, e 64,7 ± 1,3 per L3 controllo RNAi). In alternativa, l'analisi biochimica ha indicato una TAG inferiore / PL rapporto di fase L2 abbinato animali di controllo N2 (TAG / PL: 22.5 ± 2.9 per FASN-1 RNAi e 46.1 ± 3.4 per la fase di controllo abbinati RNAi, P ≤ 0,05). Quindi in questo caso può essere confermata mediante analisi biochimica che fasn-1 ha un ruolo in accumulo di lipidi piuttosto che una fase specifica riduzione della massa grassa. Il follow-up analisi dei vermi sotto forma di immagini si basa pesantemente su una piattaforma computazionale come Profiler cellulare utilizzandola WormToolbox 30. Per piccoli numeri di immagini, un servizio di piattaforma di analisi di immagini come ImageJ, liberamente disponibile presso il NIH, può essere utilizzato. Per la nostra analisi, unici script Matlab sono stati utilizzati innanzitutto identificare il bene, e, successivamente, per escludere pozzetti vuoti o quelli con le bolle, e distinguere piccoli detriti da worm. Controllo di qualità manuale era necessario per le immagini contrassegnate per l'esclusione per i motivi di cui sopra. Abbiamo trovato empiricamente che l'intensità 90 percentile di pixel a vite senza fine in un pozzo, normalizzato a zona verme in un pozzo, a condizione coerente metrica di colorazione di intensità in tutte le fasi dello sviluppo senza fine (Figura 3). Integrando massa grassa totale sull'area del verme, al contrario, tenderebbe a segnare piccoli vermi luminosi equivalentemente con grandi vermi dim. Perché il nostro metodo non integra totale segnale fluorescente sopra la zona del verme, nel prendere un percentile intensità, cambiamenti nelle dimensioni verme per sé non fannot polarizzare l'intensità misurata. Invece, le differenze nella distribuzione di intensità dei pixel vengono misurati. Tuttavia, nonostante questo, marcate differenze sono viste in colorazione distribuzione dei pixel di intensità tra animali di diversi stadi di sviluppo, per cui è importante per studiare l'effetto di qualsiasi gene di RNAi contro animali di una fase comparabile di sviluppo (Figura 3). Variabilità media tra replicati è mostrato in Figura 4 indica alta riproducibilità del metodo di colorazione grasso. Si noti che la forza del metodo è altamente dipendente ottenere immagini di qualità per ciascuna piastra, in condizioni di illuminazione uniforme, utilizzando tempi di esposizione identici, e con minime bolle, detriti, o crossover di vermi in altri pozzetti. SPE è stata eseguita su premiscelati, purificato standard per determinare il grado in cui TAG può essere separato dalla PL (Figura 5A). In questa analisi, abbiamo ottenuto un 100% separation di TAG e PL, indicata come una completa assenza di 17:00 acidi grassi derivati ​​da PL nel campione TAG e un corrispondente assenza completa di 13:00 acidi grassi derivati ​​da TAG nel campione PL (Figura 5A). Così SPE è altamente efficiente nel separare classi di lipidi. Questa analisi non indica che tutti i tag di diverse lunghezze di catena sarà purificato in modo equivalente da SPE e rilevato dal GCMS con efficienza simile. Assicura solo che TAG e lipidi PL in totale sono completamente separati tra loro. A GC-MS traccia campione di animali di tipo selvatico N2 prelevati mediante estrazione in fase solida e di preparazione FAME è mostrato in figura 5B. Sia per TAG e PL, picchi possono essere identificati sulla base del tempo di ritenzione e ioni madre e figlia sullo spettro di massa, e l'area totale sotto i picchi identificati normalizzati alla zona dei rispettivi standard interni. Per determinare la quantità normalizzata del TAG, l'areasotto tutti i picchi del cromatogramma TAG, eccetto lo standard 13:00, sono stati aggiunti insieme e divisa per l'area sotto il picco 13:00. Analogamente, per determinare la quantità totale normalizzato PL, l'area sotto tutti i picchi, eccetto lo standard 17:00, sono stati aggiunti insieme e divisa per l'area sotto il picco 17:00. I valori normalizzati per il tag e campioni PL sono quindi utilizzate per calcolare la finale TAG / PL rapporto per il campione: Va osservato che i dati di SPE-GCMS consentire un'analisi molto più sofisticato di acidi grassi presenti in ogni frazione lipidica di semplice calcolo del TAG totale rapporto PL. Per esempio, il ricercatore può integrare un singolo picco corrispondente ad un singolo acido grasso e confrontare la sua abbondanza normalizzata su campioni (es comparing in N2 wild-type rispetto daf-2 RNAi l'area integrata del picco 18:00 divisa per il picco 13:00 standard, normalizzata alla massa totale PL suddivisi per area PL 17:00 norma di picco): Qualora il ricercatore scegliere, sarebbe anche possibile determinare la percentuale di un dato acido grasso nel TAG o frazioni PL come percentuale della quantità totale di acidi grassi quantificata (18:00 come esempio nella frazione TAG in vermi N2 ): <img src="/files/ftp_upload/50180/50180fig1.jpg"alt = "Figura 1" fo: content-width = "3.25in" "> Figura 1. Flusso di lavoro tipico per l'esperimento globale. Giorno 1, congelati RNAi piastre biblioteca sono stampati su piastre LB Amp / Tet agar e incubate a 37 ° C. 2 ° giorno, Amp / Tet placche sono utilizzate per colture semi liquide di cloni RNAi in profondi blocchi pure. Giorno 3, i batteri sono concentrate per centrifugazione e trasferiti a piastre da 96 pozzetti RNAi. Giorno 4, L1 hatchling C. elegans vengono aggiunti alle piastre RNAi in liquido e lasciate asciugare. 7 giorni, gli animali vengono raccolti in un liquido, colorate con rosso Nilo nel 40% di isopropanolo, montate su vetrini da 96 pozzetti Teflon, e ripreso con un high-throughput microscopio. Figura 2. Fissativo a base di macchie rosse sul Nilo principali <em> C. elegans depositi di grasso. Rappresentante campo chiaro e fluorescenza GFP le immagini vengono visualizzate su N2 vermi nutriti con FASN-1 (piccolo, basso contenuto di grassi), lpd-3 (basso contenuto di grassi), di controllo (vettore vuoto), o daf-2 (alto contenuto di grassi) RNAi cloni. I campioni sono stati trattati come da protocollo (schema in Figura 1). Animali fissate, colorate in rosso del Nilo, e il risultato con immagini dei livelli lipidici comparabili ottenuti dalla misurazione dei lipidi biochimico. Isopropanolo-fissi del Nilo rosso livelli di fluorescenza, acquisiti da almeno 6 replicati biologici, sono riportati nella prima riga. Livelli di trigliceridi quantitative, riflettenti del totale depositi di lipidi neutri quando normalizzata per i livelli complessivi di fosfolipidi (TAG / PL), presi da 4 repliche biologiche, sono riportati nella seconda riga. È importante notare che la quantificazione assoluta raggiunta dal fissativo colorazione rosso Nilo e determinazione lipidi biochimica spesso non combaciano perfettamente. In questo caso, però qualitativamentesimile, FASN-1 (RNAi) ha una massa di trigliceridi più diverso rispetto al controllo con metodi biochimici di quanto indicato al microscopio, lpd-3 è relativamente diversa, e daf-2 (RNAi) è meno diversa, anche se tutte le differenze sono statisticamente molto significativi e misure erano altamente riproducibile. I dati riportati sono medie ± SEM (*, P ≤ 0,01; **, P ≤ 0,0001 rispetto al controllo, determinato dal non accoppiato, a due code T-test assumendo uguale varianza). Figura 3. Massa grassa determinato mediante colorazione fissazione del Nilo rosso a diversi stadi larvali. Animali sono stati coltivati ​​su OP50 batteri e raccolta alla L1, L2, L3, L4 e gravide stadi adulti di sviluppo. Le immagini sono state catturate dopo fissazione e colorazione analizzati utilizzando uno script personalizzato Matlab per determinare il 90 ° percentile of intensità dei pixel sull'area verme identificato. Si noti che i livelli di lipidi di animali di aumentare notevolmente l'animale si sviluppa da L2 a L4 fase, per poi diminuire leggermente l'animale comincia a deviare le calorie verso la proliferazione della linea germinale in fase adulta. I dati indicati sono medie ± SEM per 6-8 replicati (**, P ≤ 0,0001 rispetto adulto gravido, determinato da spaiato, due code T-test). Figura 4. Elevata riproducibilità attraverso indipendente biologica replica. Viene mostrato un diagramma a dispersione di Nilo intensità di fluorescenza rossa tutta biologica repliche (n = 6-8). Per ciascun replicato, tutti i valori sono normalizzati per l'intensità media dei controlli vettore vuoto. I dati riportati sono medie ± SEM (**, P ≤ 0,0001 rispetto al controllo, determinato dal non accoppiato, a due code T-test assumendovarianza pari). Figura 5. GC-MS cromatogrammi di SPE separati norme e TAG di tipo selvatico e l'abbondanza PL. (A) GC-MS tracce sono presenti della separazione SPE di TAG e standard PL. Notare la completa assenza di 13:00 acidi grassi nella traccia PL e l'assenza del corrispondente acido grasso 17:00 nella traccia TAG, indicando completa separazione di TAG (tritridecanoin) da PL (1,2-diheptadecanoyl-sn-glicero -3-fosfo-(1'-rac-glicerolo)). (B) Una gamma completa di rappresentante TAG e PL da un campione di tipo selvatico N2 animali alimentati con controllo vettoriale RNAi (HT115 batteri con L4440 vuoto vettore RNAi). Un microlitro di campione è stato iniettato in un 6890/5973N Agilent GCMS secondo il protocollo, e dei singoli picchi sono stati identificati dalla Reteeffetto alla volta ed i loro spettri di massa rispettivo. Abbreviazioni: cyclo, acidi grassi ciclopropano; iso:. Iso-metilico di acidi grassi a catena ramificata, GLA, acido gamma-linolenico, ALA, acido alfa linolenico, DGLA, acido gamma-linolenico diomo, EPA, acido eicosapentaenoico Clicca qui per ingrandire la figura .

Discussion

Il protocollo presentato permette un rapido screening su larga scala di livelli di lipidi in C. elegans, che può essere facilmente adattato a schermi ad alto rendimento. A differenza dei metodi usati in precedenza, che comportano un passo lungo fissazione in paraformaldeide seguito da diversi cicli gelo-disgelo 8,10, il nostro protocollo richiede una semplice fissazione di 3 minuti in isopropanolo. Abbiamo trovato che la colorazione C. elegans nel 40% di isopropanolo, diventano liberamente permeabile al rosso Nilo, senza l'impiego di ulteriori fasi di congelamento-scongelamento o fissazione. Inoltre, come rosso Nilo reagisce selettivamente in compartimenti idrofobiche nello spettro verde 18,19,31, decolorazione non è necessaria. In totale, gli animali possono essere ricavati dalle targhette RNAi per animali immagini macchiate e pronto in poco più di 2,5 ore. Questo metodo può essere eseguito relativamente a buon mercato e con elevata riproducibilità. Il metodo non dipende dalla capacità di C. elegans per l'assorbimento, o concentrato,il colorante, e quindi non ha le stesse limitazioni di alimentazione usando metodi basati su coloranti vitali. Dato riproducibilità e precisione delle misurazioni, il metodo è adatto per lo screening di un gran numero di geni da inattivazioni RNAi. Se la quantificazione dei livelli di lipidi si desidera basa su fissativo colorazione rosso del Nilo, si consiglia l'uso di 4-6 repliche biologica con gli opportuni controlli e test statistico applicato.

E 'probabile che inattivazioni gene che portano ai piccoli animali (a causa di cloni RNAi che causano lo sviluppo ritardato o arrestato) sarebbe venuto fuori da uno schermo per i regolatori di grasso, indipendentemente da qualsiasi collegamento con il metabolismo dei grassi. Mentre il programma di analisi di immagine abbiamo utilizzato conti per i vermi di diverse dimensioni normalizzando l'intensità di fluorescenza nell'area verme, singoli ricercatori possono anche prendere in considerazione confrontando i livelli di grasso colorazione di piccoli animali agli animali wild type di un equivalente stadio di sviluppo. Nelsi tratta di animali di piccole dimensioni o evolutivamente arrestato con apparente massa basso contenuto di grassi, si consiglia di non modalità singola è sufficiente a dimostrare alterazioni del metabolismo lipidico. Diversi esperimenti di follow-up, tra cui SPE-GCMS, potrebbe essere necessaria per verificare l'lipidi normativo funzione di questi geni. Per noto regolatore del metabolismo FASN-1, SPE-GCMS analisi rispetto a evolutivamente trovati N2 L2 animali di controllo è stato necessario per confermare l'apparente fenotipo basso contenuto di grassi trovato rispetto agli animali di controllo adulti. Mentre Nilo colorazione rosso grasso indicato più bassi livelli di grasso rispetto al controllo degli adulti RNAi, rispetto alla fase di controllo L2-trovati animali RNAi, nessuna differenza apparente è stata osservata. Pertanto, l'uso di un secondo metodo, cioè quantificazione biochimica del TAG / PL rapporto è stato necessario stabilire che fasn-1 è un vero regolatore di massa grassa, come fasn-1 RNAi è biochimicamente distinguibile dalla fase L2-trovati controllo animali RNAi.

<p class = "jove_content"> Mentre ci presentiamo imaging e di elaborazione per un high-throughput piattaforma, un microscopio convenzionale verticale può essere facilmente utilizzato per catturare le immagini da worm montati su cuscinetti di agarosio 20 o il formato convenzionale in Teflon stampato 8-12 vetrini da microscopio e . L'unica limitazione è che, come la fluorescenza verde di gocce lipidiche colorati con Nilo photobleaches rossi rapidamente, sistematiche e uniformi condizioni di esposizione devono essere utilizzati per garantire la comparabilità tra le immagini. Troviamo che un microscopio completamente automatizzato con condizioni uniformi di acquisizione di immagini funziona meglio in tal senso.

Uno dei punti di forza di questo protocollo è che, dopo le immagini sono raccolte possono essere salvate per il futuro ri-analisi. Le stesse immagini potrebbero essere utilizzati per determinare la dimensione del corpo in aggiunta al contenuto di grasso. Inoltre, come programmi di calcolo diventano più avanzati, c'è la prospettiva di analisi vite singola, generando risultati statisticamente significativida un singolo pozzo. Così il nostro metodo che utilizza high throughput microscopia ha alcuni vantaggi rispetto metodologie schermo pubblicati che utilizzano un Biosort Copas quantificare segnali fluorescenti 32,33. Tuttavia, le metodologie sono sicuramente gratuito.

Preciso, la determinazione biochimica del contenuto lipidico di SPE e GC / MS conferma la colorazione del Nilo rosso dei grandi negozi di grasso in C. elegans. Anche se la quantificazione assoluta raggiunta dal fissativo colorazione rossa del Nilo e la determinazione dei lipidi biochimici spesso non coincidono perfettamente, entrambi i metodi producono risultati altamente riproducibili, statisticamente significativi che concordano qualitativamente. Inoltre, questo metodo può essere personalizzato per soddisfare le esigenze specifiche dei singoli ricercatori, che possono richiedere un'ulteriore analisi delle classi separate di glicosfingolipidi, fosfolipidi, trigliceridi o presenti nei campioni vari. Va notato che altri gruppi hanno utilizzato altre tecnologie than SPE per separare classi di lipidi prima di GC / MS 22. Cromatografia su strato sottile (TLC) e cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC) ha vantaggi rispetto SPE in quanto potrebbero essere in grado di separare meglio distinti lipidi neutri (es. TAG, diacilgliceroli, acidi grassi ed esteri di colesterolo) da lipidi polari (fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina) e glicole-sfingolipidi. Abbiamo scelto SPE perché richiede un minimo di materiale di partenza (2.500-5.000 vermi), sottolinea i principali a lungo termine riserve di energia, TAG, che costituiscono la maggior parte della frazione lipidica neutro 4, ed è rapida, non richiede attrezzature specializzate o piastre. Va sottolineato che sulla base di miscele standard, SPE separa completamente TAG da PL, ed è altamente riproducibile e affidabile (vedere figura 5a). Mentre la quantificazione e analisi di esteri metilici di acidi grassi richiede un GC / MS, questa apparecchiatura è comunemente disponibile, e se non localmente, i campioni possonoessere generato come sopra e conservati a -80 ° C sotto azoto fino all'analisi di un collaboratore o commerciale GC / MS servizio è disposto.

L'uscita GCMS contiene dati ad alta risoluzione di ciascun acido grasso all'interno di ciascuna specie di lipidi. Questo permette la determinazione delle differenze dettagliate tra campioni confrontati. Come esempio, il ricercatore potrebbe determinare se il livello di alcuni acidi grassi sono stati modificati in abbondanza significativamente più di altri in daf-2, LPD-3 o fasn-1 RNAi contro controllo vettoriale. Questo strumento estremamente potente può quindi fornire informazioni dettagliate su cui sono alterate specie di lipidi in abbondanza con qualsiasi manipolazione sperimentale.

Per la nostra analisi, il più delle volte normalizzare TAG massa alla massa PL. Mentre la proteina o il DNA può anche essere utilizzato per normalizzare massa lipidica previa determinazione da una aliquota di verme pellet sonicato, troviamo che questi metodi sono soggetti a introdotto errore umano in tutte le fasi di pipettaggio e nel recupero del campione di ogni estrazione. E 'per questo motivo che abbiamo scelto di usare al posto di massa PL come il nostro fattore di normalizzazione. Norme innaturali introdotto all'inizio del protocollo (tritridecanoin per TAG, 1,2-diheptadecanoyl-sn-glicero-3-fosfo-(1'-rac-glicerolo) per PL) sono effettuate attraverso tutte le fasi della estrazione in fase solida e preparazione FAME, e garantire il recupero quantitativo e rappresentante di entrambi TAG e delle frazioni di PL. La garanzia stesso non può essere fatto se gli investigatori utilizzano proteine ​​o di DNA di normalizzare la massa TAG. Crediamo PL essere il calibro più robusta con cui confrontare i livelli di TAG su campioni, come è stato precedentemente dimostrato che PL è solo minuziosamente alterata dal medesimo stimolo effettuare spostamenti di massa grandi livelli TAG, ad esempio fame estesa o aumentata esercizio 34 – 36. PL si pensa di svolgere un ruolo strutturale, garantendo la fluidità di membrana e cellulare integrity e ruoli di segnalazione e non come accumulo di energia 37-39. Nelle nostre mani, il TAG / PL rapporto più stretto corrisponde a ciò che si ottiene con fissativo a base di lipidi con colorazione rossa del Nilo, e concorda con quello trovato da altri gruppi 21. Una strategia alternativa è utilizzato dal laboratorio Watts, in cui viene calcolata la percentuale di TAG lipidi rispetto lipidi totali 9,22,29.

L'uso di non nativi tipi di TAG e PL standard assicura che nessuna acidi grassi nativi saranno inclusi nel calcolo normalizzazione. La scelta della lunghezza della catena è puramente basato sulla necessità di queste norme per non interferire con gli spettri di massa dei nativi acidi grassi. Abbiamo trovato che gli acidi grassi di 13:00 e 17:00 servire meglio a questo scopo. E 'possibile, date le proprietà chimiche diverse di acidi grassi a catena corta, che i nostri standard innaturali acidi grassi potrebbero non essere rappresentativi di recupero di tutti catena di lunghezza acidi grassi o catene con diffindici di saturazione erenti. Così è possibile che durante SPE o GCMS potremmo vedere differenze di efficienza di depurazione o rilevamento tra lipidi di lunghezze di catena diverse. Sulla base di questo e la ionizzazione differenti di diversi acidi grassi nei GCMS, non è possibile effettuare una dichiarazione assoluta circa l'abbondanza di qualsiasi acido grasso dato. Pertanto, abbiamo solo confronto tra i campioni all'interno di un singolo esperimento abbondanze di ogni acido grasso dato. Se si volesse quantificare assolutamente un acido grasso, un modo ciò potrebbe essere ottenuto sarebbe quello di eseguire un campione preparato come descritto addizionate di una quantità nota di un stabilmente marcati con isotopi 13 versione C di tale acido grasso o simile, in modo che possa essere distinti sulla base massa dello ione genitore nel MSD, per esempio. Dato che stiamo solo confrontando quantità relative di classi di lipidi o di qualsiasi dato acidi grassi, il nostro TAG 13:00 e 17:00 standard PL servire a questo scopo in modo adeguato, ad un minimo di costo, digarantire il recupero adeguato e rappresentativo di ogni classe dei lipidi.

Fino a questo punto, c'è stata una mancanza di consenso per l'interpretazione di determinati risultati ottenuti con metodologie diverse, e fino a che le metodologie prevalenti dovrebbe essere. Complessiva va osservato che nessun metodo in isolamento è ideale per studiare il metabolismo dei grassi in C. elegans. Tuttavia, utilizzando lo screening multiplo e modalità di convalida, si può ottenere la fiducia in dati ottenuti su lipidici geni regolatori. Pertanto, si intende per nostro protocollo di servire come riferimento per il futuro lavoro nel campo della C. elegans ricerca grasso.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vorremmo ringraziare Kacergis Michael per l'assistenza tecnica e Lianfeng Wu per le discussioni e la lettura del manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto da un premio di carriera dal NIH / NIDDK (K08DK087941 di AAS), il NIH / NIDDK formazione di sovvenzione (5T32DK007028 ECP), la Ellison Medical Foundation Scholar Nuovo Premio invecchiamento (a AAS), e la H Charles . Hood Fondazione Child Research Health Award (per AAS).

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments
96-pin replicator Nunc 250520
LB Agar US Biologicals L1500
Agarose Invitrogen 16500500
Mechanical Pipettors Biohit M Line M10, M100, M300
Electronic Pipettor Biohit E Line E1200
1 M KH2PO4 Sigma P0662 pH 6.0 Sterilized by Autoclaving
1 M MgSO4 Sigma M2643 Sterilized by Autoclaving
1 M CaCl2 Sigma C2661 Sterilized by Autoclaving
NaCl Sigma S5886
5 mg/ml Cholesterol Sigma C8667 In 100% Ethanol
200 mg/ml Carbenicillin US Biologicals C1100 Filter Sterilized 0.2 μ
1 M IPTG US Biologicals I8500 Filter Sterilized 0.2 μ
100 mg/ml Ampicillin Filter Sterilized 0.2 μ
5 mg/ml Tetracycline In 100% Ethanol
Bacto Agar BD 214040
96-well TC Plates BD-Falcon 353072 For 96-well RNAi
Rectangular A/T Plates Thermo Scientific 242811 For stamping RNAi
LB Media US Biologicals L1530 Prepared as per manufacturer instructions
96-well Deep Well Assay Blocks Corning Costar 3960 Rectangular V-bottom assay block
96-well Shallow Well Assay Block Corning Costar 3956 Round V-bottom assay block
Sterile Sealing Film VWR 89134-432
Aluminum Sealing Film Corning Costar 6570 Thermowell Sealing tape for 96-well plates
M9 Buffer See Hope et al.20 See recipe below
Triton X-100 Bio-Rad 161-0407
Nile red Invitrogen N-1142
Isopropanol Fisher BP2632-4
96-pin aspirator VP Scientific VP177A-1
96-well Teflon Masked Microscope Slides Thermo Scientific Custom Can also order Trevigen 96-well Cometslide
96-well Gold-Seal Coverslides Thermo Scientific Custom Can also use second 96-well Cometslide
Deep-well PCR plate VWR 89049-178
Non-sterile adhesive film VWR 60941-070
High-Throughput Microscope Leica DM6000 fully automated with Prior 96-well stage With Chroma 49002 GFP filter set and 2x objective
Bath Sonicator Diagenode Bioruptor XL
Chloroform Sigma 366927-4L
Methanol Fisher Optima F456-4
Phospholipid Standard Avanti Polar Lipids 830456P 1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1′-rac-glycerol)
Triglyceride Standard NuChek Prep T-135 tritridecanoin
Wiretrol 50 μl Pipet Fisher 21-176-3A Drummond Scientfic
Acetone Sigma 320110-4L
Sulfuric Acid Fisher A300-500
Hexane Fisher Optima H306-1
SPE Silica Column Thermo Scientific 60108-317 Hypersep SI, 100 mg resin bed
Solid Phase Chromatography Manifold Sigma 57265 Supelco Visiprep 24-DL
Borosilicate Pipets Fisher 13-678-27F 10 ml size
Borosilicate Pasteur Pipets Fisher 13-678-8B
Borosilicate Culture Tubes Fisher 14-961-27
Threaded Borosilicate Tubes VWR 14235-460 8 ml capacity
Phenolic Caps for Culture Tubes Fisher 14-823-211
GC/MS Autosampler Vials Agilent 5188-6592
Caps for Autosampler Vials Agilent 5185-5861
GC/MS Agilent 6890 GC / 5973 MSD Outfitted with a Supelcowax-10 column

Nematode Growth Media (NGM): for 25 96-well RNAi plates, prepare 1 L of NGM:

Reagent Amount
Deionized water 1 L
NaCl 3 g
Agarose 17 g
Bacto peptone 2.5 g
Autoclave liquid cycle 121 °C for 40 min with a stir bar. Allow to cool to 60 °C stirring on a hot plate set at 60 °C. Then add the following:
1 M MgSO4 1 ml
5 mg/ml cholesterol 1 ml
1 M KH2PO4 (pH 6.0) 25 ml
1 M CaCl2 1 ml
200 mg/ml carbenicillin 1 ml
1 M IPTG 5 ml
Dispense into 96-well RNAi plates. Store at 4 °C until use, up to 2 weeks.

Rectangular Ampicillin/Tetracycline LB Agar Plates (A/T): for 20 A/T plates, prepare 1 L of media:

Reagent Amount
Deionized water 1 L
LB agar (US Biologicals) 32 g
2 M NaOH 1.5 ml
Bacto agar 2.5 g
Autoclave liquid cycle 121 °C for 40 min with a stir bar. Allow to cool to 60 °C stirring on a hot plate set at 60 °C. Then add the following:
Tetracycline 3 ml
100 mg/ml Ampicillin 0.5 ml
Dispense 45 ml into each plate. Store in dark at 4 °C until use, up to 4 weeks.

LB bacterial growth media: for 4 L, sufficient for growing and resuspending 25 96-well blocks

Mix 62 g LB powder (US Biologicals), 4 L distilled water, and 4.8 ml 2 M NaOH. Autoclave in 1 L or 0.5 L aliquots, liquid cycle, 40 min. Can be stored up to 1 year in airtight bottles at room temperature. Discard if cloudy.

100 mg/ml Ampicillin

Mix 5 g ampicillin powder and deionized water to a total volume of 50 ml. Filter sterilize 0.2 μ, dispense in 1 ml aliquots and freeze at -20 °C until use.

5 mg/ml Tetracycline

Add 1.25 g tetracycline powder to 250 ml 100% ethanol. Mix well until fully dissolved and store at -20 °C in a light-tight container.

200 mg/ml Carbenicillin

Mix 10 g carbenicillin powder and deionized water to a total volume of 50 ml. Filter sterilize 0.2 μ, dispense in 1 ml aliquots and freeze at -20 °C until use.

5 mg/ml Cholesterol

Add 1.25 g cholesterol to 250 ml 100% ethanol. Mix well and store at 4 °C for up to 6 months.

1 M MgSO4

Dissolve 120.37 g MgSO4 in 800 ml deionized water. Bring final volume to 1 L. Autoclave 40 min liquid cycle and store at room temperature.

1 M CaCl2

Dissolve 110.98 g CaCl2 in 800 ml deionized water. Bring final volume to 1 L. Autoclave 40 min liquid cycle and store at room temperature.

1 M KH2PO4, pH 6.0

Dissolve 136.09 g KH2PO4 in 800 ml deionized water. pH to 6.0 and bring final volume to 1 L. Autoclave 40 min liquid cycle and store at room temperature.

M9 Buffer: for 1 L—we routinely make 8-10 L batches

Dissolve 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4 in 900 ml. Bring final volume to 1 L. Aliquot in 100-500 ml bottles and autoclave 40 min on liquid cycle and store at room temperature.

10 N NaOH

Dissolve 400 g NaOH in 800 ml deionized water, allow to cool and bring to a final volume of 1 L. Store in 50 ml tubes at room temperature.

1 M IPTG

Add 23.81 g IPTG to deionized water and bring total volume to 100 ml. Filter sterilize 0.2 μ, dispense in 1 ml aliquots and freeze at -20 °C until use.

Egg Preparation Bleach/NaOH Solution: 20 ml sufficient for one egg preparation

Add 4 ml bleach, 1 ml 10 N NaOH, 5 ml H2O, and 10 ml M9 buffer to a 50 ml polypropylene conical tube. Make immediately before use.

Nile red stock solution

Add 50 ml 100% Acetone to 25 mg Nile red powder. Mix well and store at room temperature in light-tight parafilmed container. Can be stored for months in this manner.

Nile red staining solution: for 500 ml, sufficient for staining 30 x 96-well plates

Add 3 ml Nile red stock solution to 500 ml 40% v/v isopropanol. Store at room temperature in foil-wrapped glass bottle. Prepare immediately before use.

Phospholipid Standard

Weigh 7.6 mg phospholipid standard, 1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1′-rac-glycerol), in a glass beaker. Dissolve in 20 ml 2:1 chloroform:methanol (25 nanomoles per 50 μl). Keep covered with aluminum foil until use. Standard can also be kept at -80 °C in an airtight glass vial with phenolic cap for 1 year.

Triglyceride Standard

Weigh 6.8 mg triglyceride standard, tritridecanoin, into a glass beaker. Dissolve in 30 ml 2:1 chloroform:methanol (16.7 nanomoles per 50 μl). Keep covered with aluminum foil until use. Standard can also be kept at -80 °C in an airtight glass vial with phenolic cap for 1 year.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Zhang, S. O., Trimble, R., Guo, F., Mak, H. Y. Lipid droplets as ubiquitous fat storage organelles in C. elegans. BMC Cell. 11, 96 (2010).
  2. Kaletta, T., Hengartner, M. O. Finding function in novel targets: C. elegans as a model organism. Nature Reviews. Drug Discovery. 5, 387-398 (2006).
  3. Leung, M. C., et al. Caenorhabditis elegans: an emerging model in biomedical and environmental toxicology. Toxicological Sciences: An Official. Journal of the Society of Toxicology. 106, 5-28 (2008).
  4. Ashrafi, K., et al. Genome-wide RNAi analysis of Caenorhabditis elegans fat regulatory genes. Nature. 421, 268-272 (2003).
  5. Arda, H. E., et al. Functional modularity of nuclear hormone receptors in a Caenorhabditis elegans metabolic gene regulatory network. Mol. Syst. Biol. 6, 367 (2010).
  6. Mak, H. Y., Nelson, L. S., Basson, M., Johnson, C. D., Ruvkun, G. Polygenic control of Caenorhabditis elegans fat storage. Nature Genetics. 38, 363-368 (2006).
  7. Wang, M. C., O’Rourke, E. J., Ruvkun, G. Fat metabolism links germline stem cells and longevity in C. elegans. Science. 322, 957-960 (2008).
  8. O’Rourke, E. J., Soukas, A. A., Carr, C. E., Ruvkun, G. C. elegans major fats are stored in vesicles distinct from lysosome-related organelles. Cell Metab. 10, 430-435 (2009).
  9. Brooks, K. K., Liang, B., Watts, J. L. The influence of bacterial diet on fat storage in C. elegans. PLoS ONE. 4, e7545 (2009).
  10. Yen, K., et al. A comparative study of fat storage quantitation in nematode Caenorhabditis elegans using label and label-free methods. PLoS ONE. 5, (2010).
  11. Rabbitts, B. M., et al. glo-3, a novel Caenorhabditis elegans gene, is required for lysosome-related organelle biogenesis. Genética. 180, 857-871 (2008).
  12. Kimura, K. D., Tissenbaum, H. A., Liu, Y., Ruvkun, G. daf-2, an insulin receptor-like gene that regulates longevity and diapause in Caenorhabditis elegans. Science. 277, 942-946 (1997).
  13. Soukas, A. A., Kane, E. A., Carr, C. E., Melo, J. A., Ruvkun, G. Rictor/TORC2 regulates fat metabolism, feeding, growth, and life span in Caenorhabditis elegans. Genes Dev. 23, 496-511 (2009).
  14. McKay, R. M., McKay, J. P., Avery, L., Graff, J. M. C elegans: a model for exploring the genetics of fat storage. Dev. Cell. 4, 131-142 (2003).
  15. Klapper, M., et al. Fluorescence-based fixative and vital staining of lipid droplets in Caenorhabditis elegans reveal fat stores using microscopy and flow cytometry approaches. J. Lipid Res. 52, 1281-1293 (2011).
  16. Hellerer, T., et al. Monitoring of lipid storage in Caenorhabditis elegans using coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 14658-14663 (2007).
  17. Wang, M. C., Min, W., Freudiger, C. W., Ruvkun, G., Xie, X. S. RNAi screening for fat regulatory genes with SRS microscopy. Nat. Methods. 8, 135-138 (2011).
  18. Fowler, S. D., Greenspan, P. Application of Nile red, a fluorescent hydrophobic probe, for the detection of neutral lipid deposits in tissue sections: comparison with oil red. 33, 833-836 (1985).
  19. Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets. J. Cell Biol. 100, 965-973 (1985).
  20. Hope, I. L. . C. elegans: A Practical Approach. , 304 (1999).
  21. Perez, C. L., Van Gilst, M. R. A 13C isotope labeling strategy reveals the influence of insulin signaling on lipogenesis in C. elegans. Cell Metab. 8, 266-274 (2008).
  22. Watts, J. L., Browse, J. Dietary manipulation implicates lipid signaling in the regulation of germ cell maintenance in C. elegans. Biología del desarrollo. 292, 381-392 (2006).
  23. Wang, T. J., et al. Metabolite profiles and the risk of developing diabetes. Nature medicine. 17, 448-453 (2011).
  24. Rhee, E. P., et al. Lipid profiling identifies a triacylglycerol signature of insulin resistance and improves diabetes prediction in humans. The Journal of Clinical Investigation. 121, 1402-1411 (2011).
  25. Lewis, G. D., et al. Metabolic signatures of exercise in human plasma. Science translational medicine. 2, 33-37 (2010).
  26. Rhee, E. P., et al. Metabolite profiling identifies markers of uremia. Journal of the American Society of Nephrology : JASN. 21, 1041-1051 (2010).
  27. Gerdt, S., Lochnit, G., Dennis, R. D., Geyer, R. Isolation and structural analysis of three neutral glycosphingolipids from a mixed population of Caenorhabditis elegans (Nematoda:Rhabditida). Glycobiology. 7, 265-275 (1997).
  28. Christie, W. W. . Advances in Lipid Methodology – Two. , 69-111 (1993).
  29. Watts, J. L., Browse, J. Genetic dissection of polyunsaturated fatty acid synthesis in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5854-5859 (2002).
  30. Wahlby, C., et al. An image analysis toolbox for high-throughput C. elegans assays. Nat. Methods. , (2012).
  31. Fowler, S. D., Brown, W. J., Warfel, J., Greenspan, P. Use of nile red for the rapid in situ quantitation of lipids on thin-layer chromatograms. J. Lipid Res. 28, 1225-1232 (1987).
  32. Squiban, B., Belougne, J., Ewbank, J., Zugasti, O. Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans. J. Vis. Exp. (60), e3448 (2012).
  33. Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains. J. Vis. Exp. (51), e2745 (2011).
  34. Comizio, R., et al. Total body lipid and triglyceride response to energy deficit: relevance to body composition models. The American journal of physiology. 274, E860-E866 (1998).
  35. Lee, R. F., Paffenhofer, G. A., Nevenzel, J. C., Benson, A. A. The metabolism of wax ters and other lipids by the marine copepod, Calanus helgolandicus. J. Lipid Res. 11, 237-240 (1970).
  36. Lee, S. S., et al. Requirement of PPARalpha in maintaining phospholipid and triacylglycerol homeostasis during energy deprivation. J. Lipid Res. 45, 2025-2037 (2004).
  37. Singer, S. J. A fluid lipid-globular protein mosaic model of membrane structure. Annals of the New York Academy of Sciences. 195, 16-23 (1972).
  38. Singer, S. J., Nicolson, G. L. The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. Science. 175, 720-731 (1972).
  39. Turkish, A. R., Sturley, S. L. The genetics of neutral lipid biosynthesis: an evolutionary perspective. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 297, E19-E27 (2009).

Tags

Caenorhabditis ElegansLipid DropletsNile Red StainingHigh-throughput MicroscopyTriglyceridesPhospholipidsGas Chromatography-mass Spectrometry

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Pino, E. C., Webster, C. M., Carr, C. E., Soukas, A. A. Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans. J. Vis. Exp. (73), e50180, doi:10.3791/50180 (2013).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image