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Biología

生化和高通量的微观评估的脂肪含量<em>秀丽隐杆线虫</em

Published: March 30, 2013
doi:
10.3791/50180
, , ,
1Center for Human Genetic Research and Department of Medicine,Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School, 2Department of Earth, Atmospheric, and Planetary Sciences,Massachusetts Institute of Technology

Summary

我们提出了强大的生化和微观的研究方法<em>秀丽隐杆线虫</em>脂质店。一种快速，简单，固定，染色过程利用荧光脂滴成像光谱特性的亲脂性染料尼罗红。然后，我们提出的甘油三酯和磷脂固相萃取和气相色谱 – 质谱法的生化测定。

Abstract

线虫C.线虫已成为保守的遗传途径，调节脂肪代谢，因为它涉及到人类肥胖及其相关的病理研究的重要模式。一些以前的方法的可视化的 C开发线虫富含甘油三酯的脂肪储存，已经被证明是错误的，突出的细胞区室以外的脂滴。其他方法需要专门的设备，耗费时间，或产生不一致的结果。我们介绍一个快速，重现性好，固色剂为基础的尼罗红染色法的准确和快速检测的中性脂肪滴在C.线虫 。快速固定在40％异丙醇中的步骤，使动物完全可渗透的尼罗红，然后将其用于染色动物。此亲脂性染料的光谱性能允许它强烈和选择性荧光的黄绿色的频谱只在富含脂质的环境下，而不是在多个时极地环境。因此，可以可视化的脂滴在荧光显微镜简单的绿色荧光蛋白的成像能力，配备了后只有一个简短的尼罗红染色步骤在异丙醇。本协议的速度，可负担性和可重复性，使得它非常适合于高通量筛选。我们也表现出成对的生化测定甘油三酯和磷脂用气相色谱法，质谱分析方法。这种更严格的协议，应使用从尼罗红微观血脂测定结果的确认。我们预计，这些技术将成为新的标准，在该领域的C.线虫代谢的研究。

Introduction

保护人类和线虫的代谢途径之间，使之成为一个强大的模式生物，研究肥胖。虽然C。线虫不具有专用像在哺乳动物脂肪储存的脂肪细胞，它们做店甘油三酯在脂滴1中，并具有许多相同的调节脂肪储存和能源使用2,3。为了测定C.脂肪含量线虫的几种方法已经提出了不同程度的易用性和成功。最近一次普遍使用的荧光灯，重要的染料4-7被质疑，这些试剂被证明是染色的不同C.主要的脂肪储存仓库的一个隔间线虫 1,8-11。非荧光染料固色剂为基础的，如苏丹黑油红-O，而强调脂滴的蠕虫病毒12-14取得成功，不会有大的动态范围，作为荧光定量百分之染料8,13,15。此外，荧光和非荧光染料固定电流的方法是费时和冻融涉及多个步骤和/或使用的有毒化学品1,9,10。使用特定BODIPY-标记的脂质类似物已报道当馈送到生活与短期标签15蠕虫时，以突出显示脂滴。然而，这依赖于染料的吸收，并因此由C.偏压的处理和BODIPY脂肪酸的代谢类似物。已建立的脂质染色的染料是无标记，相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）或受激拉曼散射（SRS）显微镜，利用脂质分子的的特征振动特性的可视化脂肪储存10,16， 17。然而，此方法需要昂贵的专用设备是，充其量是低吞吐量。

为了满足需要快速，可扩展的ANALYsis文件的中性脂质店的C.线虫代谢的研究中，我们将介绍一种新型的，高固色剂为基础的尼罗红脂质染色重现性的方法。的亲脂性染料尼罗红光谱和物化性质诱导在其激发发光峰的黄色-金-光谱的移位，允许它只有当在富含脂质的环境中，但不是在极性较大的环境18中的绿色的发光光谱的荧光，19。因此，脂滴简单染色后，可以检测出所使用的绿色荧光蛋白（GFP）的过滤器设定为荧光显微镜。这项技术的易用性和可负担使得它非常适合于高通量筛选。我们还演示了配对的生化测定甘油三酯和磷脂固相萃取和气相色谱 – 质谱法，严格的方法。生化血脂测定与尼罗红为基础的微观测定C.的发吨的质量，并应作为与微观血脂测定结果的确认。

Protocol

1。矩形安培/ TET（A / T）的LB琼脂平板和NGM的IPTG RNA干扰板的制备应制备的A / T板前1-4周，使用并储存在黑暗中在4℃下对于1 L的媒体加到1升的去离子水，32克的LB琼脂，1.5毫升2 M的NaOH，和2克Bacto琼脂。液循环高压灭菌40分钟。后冷却至60℃，加入3毫升四环素和0.5 ml氨苄青霉素。倒入45毫升的媒体，每块板。 96 RNA干扰板准备提前3天至2周。 要倒入25 96孔的RNAi板，准备1 L的线虫的生长介质（NGM）：1升的去离子水，3克氯化钠，17克琼脂糖，和2.5克细菌蛋白胨。高压釜液循环，在121°C为40分钟，搅拌棒。放凉至60°C，搅拌热板集当冷却至60℃，加入以下股票的解决方案：1毫升1米硫酸镁 ，1毫升5毫克/毫升的胆固醇，25毫升1 M KH 2 </suB̶：> PO 4（pH 6.0）中，1毫升的1M的CaCl 2，1毫升200毫克/毫升的羧苄青霉素，和5ml 1M的IPTG（见材料表食谱）。 分送平底96孔板中使用电子的多通道移液器到每个孔中加入150μl的RNAi媒体。避免气泡。保持介质浸渍在60℃的水浴中，同时分配在一个无菌的不锈钢容器。 保持RNA干扰板的水平，直到琼脂糖巩固。板可以倾长达2周的提前，并储存在4℃下第1天 2。邮票冷冻库板到矩形安培/ TET（A / T）的LB琼脂平板上 A / T牌暖到室温，让他们在黑暗中。 转移96 – 孔的RNAi库板从-80℃干冰。附近的本生灯打开密封铝盘。 杀菌96针复制器串联浸渍销（每次10秒），在10％的漂白剂，去离子H 2 O，和70％E“TOH随后通过引脚通过一个火焰。重复乙醇和火焰步骤。 应用复制到冷冻96的RNAi甘油，确保每个引脚接触面每口井。 A / T板，邮票上画一个小圆圈，每个引脚不破坏琼脂表面。 再密封和返回图书馆板至-80℃。孵育加盖A / T板在37°C过夜细菌的生长。 第2天 3。长大RNA干扰的细菌克隆隔夜在深井块 37°C和A / T牌，确认细菌的生长。 填充一个96孔的深阱块的每个孔中，用1.5毫升用200微克/毫升的羧苄青霉素的LB。 消毒96针复制（见2.3）。 应用复制到A / T板的顶部，确保引脚接触各种细菌的RNA干扰克隆。提起复制到深井块，浸引脚。漩涡，慢慢松开，使CErtain不污染邻井。 呼吸容易膜密封块。孵育过夜，在37℃下搅拌（​​950 rpm离心在MT Infors Microtiteron II摇床，优选的，或250 rpm在一个25毫米掷摇床中）。 第3天 4。种子的RNAi细菌无性系到96孔NGM的RNAi板上删除96的RNAi板4°C温至室温。 删除深井块，并在4000×g离心10 min。 快速反转块成片漏媒体的，并加盖倒到纸巾上，以消除多余的介质。 在层流罩下，添加40微升的LB的各孔和密封用无菌膜用200微克/毫升的羧苄青霉素。 返回块至室温细菌摇床10分钟，再悬浮的颗粒，或手动重新悬浮通过小心地移液粒料。 在层流罩，取出无菌薄膜和转移细菌深到96孔的RNAi板以及块。加入40μl再悬浮细菌行数'A'和'H'，和35μl从所有其他行。更多的液体被加入到边缘的孔中的96 – 孔的RNAi板，以防止过分干燥和开裂的琼脂糖。 保留4-6小时晾干罩板发现，检查定期为干燥。干菌呈透明的，不混浊。盖，反转板，室温孵育过夜。 5。准备同步人口的蠕虫鸡蛋准备每6 96的RNAi板的用于两个10公分板充满了许多怀孕的蠕虫。请务必蠕虫的非饥饿状态至​​少两代（7天）。 准备一个同步人口L1如前所述的20。对于20毫升的漂白剂溶液，使用的NaOH（10 M）1毫升5毫升去离子H 2 O，和10毫升M9的缓冲液4毫升漂白剂，。 过夜同步蠕虫在10ml M9在一个15毫升无菌聚丙烯管中在20℃下与旋转第4天 6。蠕虫的RNAi板以3,000×g离心1分钟，离心蛋税号。吸出上清液，远离L1刚孵化的颗粒。 5毫升M9的缓冲液重悬在0.0005％的Triton X-100的。添加少量的洗涤剂防止蠕虫粘到吸移管和没有对脂​​肪染色效果。 显微镜下计数蠕虫。如果有必要，调整浓度每微升至10-15蠕虫。 在层流罩中，为每个96孔板中接种，成一排的一个浅孔分析块的各孔中加入75微升的重新悬浮的蠕虫。使用手动多道移液器，添加50-75蠕虫于5μl到各孔，96孔的RNAi板。 允许板，在通风橱中进行30〜60分钟的干燥。干燥时，在显微镜下，蠕虫病毒应该会出现爬行，不抖动。 成长蠕虫病毒的RNAi板在20°C〜64小时。 7天 7。修复，并在尼罗红染色蠕虫从孵化器中删除的RNAi板。在显微镜下检查和记录饿死或抖动（湿）井排除进一步的分析，这些条件会影响脂肪的质量。 使用的电子重复移液器，添加150微升PBS，0.01％的Triton X-100的到的RNAi板的各孔中。一个手动多道移液器，结构和传输液体的蠕虫深96孔PCR板中的相应行。避免破坏琼脂。共PBS，每孔300μL蠕虫在重复上述步骤。 当四个板已经转移，板以500rpm离心1分钟。 吸液上清液，使用96针的真空抽吸器，在井的底部离开〜25微升的液体和蠕虫颗粒。 添加150μl的40％异丙醇的各孔固定动物。足够高的速度肯定的是，移液器混合蠕虫沉淀用40％的异丙醇。在室温下孵育3分钟。 离心机板揭露，持续1分钟，在500 rpm的转速下。 吸弃上清液，用96针吸气器或手动，只留下25微升40％的异丙醇+蠕虫在井的底部沉淀。 向每孔加入150μl的尼罗红染色溶液在使用前立即制备：6微升尼罗红的0.5毫克/毫升在丙酮中每1毫升的40％的异丙醇的原液。 密封板与非无菌粘接膜和至少2小时，在黑暗中染色。 8。洗净，图片蠕虫在高通量显微镜为1分钟，在500 rpm的转速下离心和吸但25μl的尼罗红染料。 加入150μl的PBS，0.01％的Triton X-100的各孔中，并存储在至少30分钟的暗。 以500rpm离心1分钟。 从每口井的底部有2个7微升快速使用12通道移液器，吸动物冲程和分配到一个96孔的聚四氟乙烯印刷载玻片上。小心，不删除蠕虫，从每口井的幻灯片中删除9.5μl的PBS。如果你的玻璃的幻灯片不适合直接在显微镜安装，自定义加工铝滑轨持有人必须被用来发动蠕虫。 慢慢的下盖滑到96幻灯片。这个步骤可能需要一些做法，以避免气泡或跨越到其他井的蠕虫病毒。用粘合剂粘性的安全角落。 明场和荧光与GFP / FITC滤光片自动显微镜的图像幻灯片。脂质信号的光漂白剂容易，所以它应该有系统地成像在所有的井，手动，，作为漂白会导致人工井之间的差异。分析的详细信息，请参阅代表性成果和讨论。 9。生化血脂测定采用固相萃取（SPE）和气相色谱 – 质谱法（GC / MS） <p class="“jove_content”">验证尼罗红荧光血脂水平的基础上，然后通过质谱分析（GC / MS），气相色谱法，可以执行的脂肪酸甲基酯（FAME），甘油三酯（TAG）和磷脂（PL）从来自蠕虫病毒颗粒。涉及有机物的步骤应在通风橱中进行。应小心，脂质保持避光在氮气氛下，在延长的贮存或孵育步骤，因为它们是非常容易氧化。蜗轮从2,500-5,000同步动物粒料被用作输入，完全相同的，除了上述制备动物生长于10厘米的RNAi板。 洗净2,500-5,000蠕虫从每个10厘米板用10ml M9缓冲液到15毫升锥形聚丙烯管。佩莱蠕虫在500×g离心一分钟，并再次用10ml M9的缓冲液洗沉淀。佩莱在500×g的动物。吸干离开250微升总体积，和任一冷冻液氮并存储在-80℃下，在氮气氛下FOŕ后处理或直接进入。 该蠕虫病毒颗粒可采取直接步骤9.3，如果甘油三酯质量是被归到磷脂质量8,13,21。然而，如果研究者希望正常化蛋白质含量或DNA含量，蜗杆沉淀应超声处理10分钟，30秒开，30秒关，在4℃下的浴中的强度最高的超声波发生器上如果蛋白质或DNA正常化的需要，取出5微升等份，并用Bradford试剂或相似或总DNA含量柱净化后，用紫外分光光度计测定总蛋白浓度。 加入到1.5 ml 2:1的氯仿：甲醇在一个线程的高硼硅玻璃管的蠕虫。所有的有机溶剂，应使用玻璃吸管转移。 使用wiretrol 50微升吸，加25海里磷脂在50μl的标准，和16.7 nm的甘油三酯在50μl的标准。这两种标准都应该溶于2:1的氯仿：甲醇，盖紧，并储存在氮气氛下从光在一个-80℃的冰箱中，以避免氧化保护。 酚醛帽帽和涡。提取物在室温下1小时，每15分钟涡旋式。 以1,000 rpm离心5分钟。没有尸体的下层有机相转移到文化硼硅管。 加0.3毫升0.9％NaCl溶液中，旋涡和离心机在1,000 rpm离心5分钟。 底部有机层转移到一个新的硼硅酸盐的培养管中，确保不超过任何的水相转移。 在氮气氛下的干燥有机相。首先固相萃取（SPE）重悬干脂质在1毫升氯仿。另外，对于详细不同的脂质类，包括磷脂类，糖脂，鞘脂，甘油二酯，甘油三酯，游离脂肪酸，和胆甾醇酯的分离和分析，薄层色谱法，率先在 C由瓦特实验室线虫 22可以用于代替的SPE。血脂可也是BË分离高效液相色谱法和组分分析GCMS。也可用于复杂的方法的的全lipidome剖析者liquid-chromatography/MS（LCMS）23-26。 组装硅胶固相萃取柱SPE歧管。预平衡的柱用3毫升氯仿。允许溶剂通过重力流。 脂质样品加载到SPE柱，收集流过作为第一馏分（TAG分数）的一部分，在一个带螺纹的硼硅管。大多数中性脂肪会通过在这第1毫升流过。加入3毫升氯仿，充分洗脱TAG部分，收集流过的TAG部分管。 删除和CAP的第一个集合管，并用干净的收集管更换。用5毫升9:1的丙酮：甲醇洗脱鞘糖脂。但是，我们并没有惯常分析该馏分的脂肪酸组合物，它可能包含有价值的信息，并且可以保存用于制备甲基酯和免费的鞘氨醇碱作进一步的分析利用如先前所述的TAG和PL 27的不同的专门程序。 更换的第二螺纹高硼硅收集管的糖脂收集管。用3毫升甲醇（PL馏分）洗脱磷脂。 馏分可以被存储在-80℃下在这一点上在氮气下盖紧。干纯化的氮气氛下的脂质。为了加快干燥，在干燥的加热块在33°C。绝不会储存在干燥的形式，因为它们是在干燥的状态下特别是易被氧化的脂类。 重悬干燥的脂质成分在2毫升2％H 2 SO 4在甲醇涡旋和孵育过夜，在55℃水浴创造脂肪酸甲酯盖紧。必须小心，绝对没有得到的FAME反应中的水，这将极大地抑制脂质衍生。我们已经找到更有效的衍生过夜培养和文献表明，减少脂质过氧化反应在较低温度下发生杜里吴FAME准备28。的另一种更快速的方法是使用在甲醇中的2毫升2.5％H 2 SO 4和衍生化一小时，在70或80℃21,22,29。 第二天早上，从浴中删除，并允许冷却。添加1.5毫升H 2 O（以淬灭反应），然后0.3毫升己烷（提取的脂肪酸甲酯）到每个文件TAG和PL馏分。用力摇晃，并在1000转离心5分钟。 非常小心地取下顶部正己烷层使用标准的移液器或巴斯德吸管。分装到自动进样器管。请一定不包含任何酸化甲醇，因为这会破坏气相色谱柱和MSD。 到GC / MS帽和负载样品。将样品传送到微插入安捷伦封端的PTFE-硅氧烷PTFE螺丝帽的小瓶在己烷中。它被转移到安捷伦的GCMS模型6890/5973N配备Supelcowax-10（24079）30米，250微米的石英毛细管柱。一微升注入诠释办公自动化不分流进样口设置在250℃和13.33 PSI超纯氦气使用的载气。该协议运行在一个恒定的1毫升每分钟如下： 步骤 指令 目标温度 1 保持2分钟 150°C 2 斜10°C每分钟 200°C 3 保持4分钟 200°C 4 斜5°C每分钟 240°C 5 保持3分钟 240°C 6 斜10°C每分钟 270°C 7 保持5分钟 270°C 溶剂延迟3分钟，在MSD使用的过滤，以最大限度地减少磨损阿曼特。此后，在50和550之间道尔顿群众与MS四倍集检测在150℃下和ms的源设置在230℃，与热辅助温度为270℃。

Representative Results

已采取通过脂肪染色的工作流程的成像板的一个例子是在图1中所示。具体控制高脂肪（DAF-2胰岛素受体​​RNA干扰），低脂肪（LPD-3蛋白在肠道中的RNA干扰脂质颗粒），小和低脂肪（脂肪酸合成酶FASN-1 RNAi）技术，和空载体（控制）显示的变化的荧光强度，根据动物的脂肪含量，以及相应的脂质由GC / MS分析（ 图2）确定的金额。请注意，基因失活导致发育被捕的，小动物往往会出现比成人的控制动物脂肪要低得多，不论任何脂肪代谢的连接（ 图3）。进一步的分析，包括染色分析和脂质生物化学与SPE-GCMS的野生型对照动物相似的发展阶段，必须采取措施来确保其正确性小或发育被捕了积极的命中。在FASN-1 RNA干扰（ 图2），无论是在L2或L3幼虫期的动物逮捕，并有脂肪染色低于成年对照RNA干扰的，但类似的丰富L2-L3级控制的RNAi的动物（脂肪染色％的情况下，成人的控制RNA干扰：49.9±FASN-1 RNA干扰和20.2±4.5％，2.1％L2控制RNA干扰，64.7±1.3 L3控制RNA干扰）。另外，生化分析表明，较低的TAG / PL比比L2的阶段相匹配N2控制动物（TAG / PL：22.5±2.9 FASN-1 RNA干扰和46.1±3.4阶段相匹配的对照RNA干扰，P≤0.05）。因此，在此实例中，它可以通过生化分析证实，FASN-1具有在脂质存储作用，而不仅仅是一个阶段特异性的脂肪量减少。 后续的成像蠕虫的分析在很大程度上依赖于一个计算平台，如细胞探查WormToolbox 30。对于更小的数量的图像，如ImageJ的，可自由查看从NIH，一个公开可用的图像分析平台可以被使用。在我们的分析，独特的Matlab脚本首先用于识别以及随后排除井空或有气泡，从蠕虫和区分小碎片。手动的质量控制是必需的标记的图像为上述提到的原因中排除。我们的经验发现，90百分位之间的蠕虫像素强度良好，规范化蠕虫以及在一个区域，提供了一致的度量染色强度的蠕虫病毒发展的各个阶段（ 图3）。总脂肪量集成在该区域的蠕虫病毒，相反，往往会大昏暗的蠕虫等效得分明亮的小蠕虫。因为我们的方法并不总荧光信号集成在该区域的蠕虫病毒，本身的强度百分虫大小的变化不吨偏见测得的强度。相反，在像素中的强度分布的差异的量。但是，尽管这样，明显的差异被视为在染色的不同发育阶段的动物之间的像素的强度分布，因此，重要的是要研究可比发育阶段（ 图3）对动物的任何基因的RNAi的效果。高再现性的脂肪染色法表示在图4中示出重复间的平均变异。请注意，该方法的强度是高度依赖于获得高质量的图像的每个板，均匀的照明条件下，使用相同的曝光时间，并以最小的气泡，碎片，或交叉成其他井的蠕虫。 SPE上进行预混合，纯化的标准，以确定其中的TAG的程度是可以分离从PL的（ 图5A）。在这种分析中，我们实现了100％Separation的TAG和PL，十七点〇 〇分来自从PL的脂肪酸中的TAG样本和一个相应的13时〇 〇分来自TAG在PL样品（ 图5A）的脂肪酸完全没有指明是完全没有。因此，SPE是高效分离脂质类。这种分析并不表示不同链长的所有的TAG将等效纯化由SPE和检测通过GCMS相似的效率。它仅仅保证TAG和PL血脂总彼此是完全分开的。 N2野生型动物，通过固相萃取和FAME准备一个样品GC-MS跟踪， 如图5B所示。对于这两个文件TAG和PL，峰可以识别根据保留时间和质谱父和女儿离子的上的，并根据确定的归一化的区域的各自的内部标准的峰的总面积。要确定的归一化量的TAG，区域根据所有的TAG色谱峰，除13时零零分标准，加入在一起，并除以十三时00的峰值下的面积。同样地，以确定的归一化总的PL量，所有峰下的面积，除17时00分的标准，一起加入并根据17点〇〇分峰的面积除以。的TAG和PL样品然后用归一化的值来计算最终的文件TAG / PL比样品： 应当指出，数据从SPE-GCMS允许一个更复杂的分析本比简单的计算总TAG向PL的比例在每个脂质组分的脂肪酸。例如，研究者可以集成一个单峰，对应于一个单一的脂肪酸和样本之间的比较其归一化的丰度（ 例如c的daf-2的RNAi 13点○○分标准峰，归一化至总的PL的质量除以由PL 17:0标峰面积）除以18时〇 〇峰的积分面积在N2的野生型与omparing： 如果研究者选择，它也将是可能的，以确定的百分比中的任意给定的脂肪酸作为脂肪酸的总量的百分比的TAG或PL馏分定量（作为一个例子十八时〇〇分在N2蠕虫在TAG馏分）： <img src="/files/ftp_upload/50180/50180fig1.jpg"alt ="“图1”佛：内容宽度=“3.25in”的FO：src" > 图1。典型工作流程的整体实验第 1天，冷冻的RNAi库板印到安培/春节LB琼脂平板上，在37℃孵育第2天，AMP / TET板用于种子液培养的RNAi克隆深井块。第3天，细菌通过离心浓缩，并转移到96孔的RNAi板。第4天，L1幼体C.线虫被添加到在液体中的RNAi的板，并使其干燥。第7天，动物收集在液体中，用尼罗红染色，在40％异丙醇中，安装在96孔的聚四氟乙烯的幻灯片，并具有高吞吐量的显微镜成像。 图2。固色剂为基础的尼罗红渍主要 <em> C. N2蠕虫喂线虫的脂肪储存。代表光明的领域和GFP荧光图像显示FASN-1（小型，低脂肪），LPD-3（低脂肪），对照组（空载体），或DAF-2（高脂肪） RNAi技术克隆。样品处理按照协议（在图1中示意性）。动物固定的，在尼罗红染色，生化血脂测定和比较血脂水平所获得的成像结果。异丙醇固定尼罗红荧光水平，至少6个生物学重复获取，在第一行中所示。定量甘油三酯水平，反映整体中性脂肪存储标准化的整体磷脂水平（TAG / PL），从4生物复制，显示在第二行。重要的是要注意，从固定液尼罗红染色和生化脂质测定实现的绝对定量往往不完全匹配。在此实例中，虽然定性FASN-1（RNAi）的相似，有更多的不同的甘油三酯质量通过生物 ​​化学的方法比在显微镜下观察表明与对照组比较，则lpd-3同等不同， 的daf-2（RNAi）是少不同，虽然所有的差异是高度统计学显着测量结果重现性好。显示的数据以均数±SEM（*，P≤0.01，** P≤0.0001相对控制，由未成，双尾T-测试等方差假设）。 图3。脂肪的质量确定的固定在不同的幼虫阶段的尼罗红染色。动物上生长OP50细菌，并收集在L1，L2，L3，L4和妊娠成年发育阶段。固定染色后，图像被抓获，并使用自定义的的MATLAB脚本来确定的第 90百分位Ø分析f以上确定的蠕虫面积的像素强度。请注意的动物，血脂水平大大提高作为动物发展从L2到L4阶段，然后稍微下降的动物开始转移热量向成年阶段的种系中的增殖。显示的数据以均数±SEM重复6-8（**，P≤0.0001相对于妊娠成人，由未成，双尾T检验）。 图4。高重复性在独立的生物复制。显示的是整个生物的尼罗红的荧光强度的散点图复制组（n = 6-8）。对于每个重复中，所有的值被归一化到空载体对照的平均强度。显示的数据是平均±SEM（**，P≤0.0001相对控制，由未成，双尾T检验假设等方差）。 图5。 GC-MS色谱图，固相萃取分离的标准和野生型文件TAG和PL丰度 （A）的GC-MS分析的痕迹的SPE分离的TAG和PL标准所示。注意完全没有在PL跟踪的13点〇 〇脂肪酸的TAG跟踪的的十七点○○脂肪酸在相应的情况下，表示完全分离从PL的TAG（tritridecanoin）（1,2 – diheptadecanoyl-sn-甘油-3-磷酸-（1'-rac-甘油））。 （b）代表全方位的TAG和PL从样品的N2野生型动物喂食矢量控制HT115细菌L4440空载体的RNA干扰（RNA干扰）。根据该协议，1微升的样品被注入的Agilent 6890/5973N GCMS和个别高峰被确定了支撑架很多功夫的时间和他们各自的质谱。缩写：环，环丙烷脂肪酸，ISO感光度：ISO-甲基支链脂肪酸，亚麻酸，γ-亚麻酸，ALA，α-亚麻酸; DGLA，二高γ-亚麻酸，EPA，二十碳五烯酸。 点击此处查看大图 。

Discussion

该协议允许进行快速，大规模筛选C.血脂水平线虫 ，它可以很容易地适应高吞吐量屏幕。与以前使用的方法，它涉及一个漫长的一步，多聚甲醛固定的几个冻融循环8,10，我们的协议需要一个简单的3分钟固定在异丙醇。我们已经发现，通过染色C.线虫在40％异丙醇，它们成为可自由可渗透的尼罗红（Nile red），而不使用额外的冻结-解冻或固定步骤。此外，尼罗红（Nile red）选择性荧光在绿色光谱18,19,31疏水隔室的，没有脱色是必要的。总体而言，可以采取动物，从RNA干扰板的图像动物染色，并准备在刚刚超过2.5小时。此方法可以执行相对廉价且具有高的再现性。该方法不依赖于C 的能力线虫吸收或浓缩的染料，并因此不具有供给为基础的方法，用活体染料相同的局限性。由于测量的再现性和精度的方法，该方法是适合于通过RNAi筛选大量的基因失活。血脂水平的定量所需的尼罗红染色后固色剂，我们建议使用4-6次生物学重复与适当的控制和统计测试应用。

这是可能的，很多小动物的基因失活，导致由于RNAi技术克隆造成延误或逮捕发展出来的脂肪监管机构的屏幕，无论任何连接到脂肪代谢。虽然图像分析程序中，我们通过标准化的荧光强度的蠕虫，利用不同大小的蠕虫占个别研究人员也可能要考虑比较相似的发展阶段的小动物，野生动物的脂肪染色水平。在具有明显的低脂肪量小或发育拘捕的动物的情况下，我们认为没有单一的模式是足以证明脂质代谢的改变。几个后续实验，包括SPE-GCMS，必须确定这些基因的的脂质调节功能的。发育匹配N2 L2控制动物相比，对于已知的代谢调节FASN-1，SPE-GCMS分析是必要的，以确认明显的低脂肪的表型发现成人对照动物相比时。虽然尼罗红脂肪染色显示低脂肪含量相对RNA干扰技术，控制成年阶段相匹配的L2控制RNA干扰动物相比，没有明显的差异可见一斑。因此，使用第二个方法， 即生化定量的TAG / PL比是必要的，以确定一个FASN-1的是一个真正的调节器的脂肪量，FASN-1 RNAi是生化区别于阶段匹配L2控制的RNAi动物。

<p c姑娘="的“jove_content”">虽然我们提出了一种高通量平台的成像和处理，传统的直立显微镜可以很容易地被用来捕捉图像从蠕虫安装在琼脂糖凝胶垫20或常规尺寸的聚四氟乙烯印刷8至12孔显微镜载玻片。唯一的限制是，迅速尼罗红染色，光漂白剂的脂滴的绿色荧光，系统化，需要使用统一的曝光条件，以确保图像之间的可比性。我们发现，一个完全自动化的显微镜具有均匀的图像采集条件下效果最好这种效果。

本协议的一大优点是图像收集后，他们可能会被保存为未来的再分析。可以使用相同的图像，来确定车身尺寸除了脂肪含量。此外，由于计算程序变得更加先进，有单蠕虫的前景分析，产生统计上的显著成效从一个单一的井。因此，我们的方法，利用高通量显微镜具有一定的优势出版的屏幕的方法，使用COPAS Biosort的量化荧光信号32,33。但是，这些方法是绝对免费的。

精确，生化测定脂肪含量的固相萃取和GC / MS证实了尼罗红染色的主要脂肪储存在 C 线虫 。虽然实现了从固定剂尼罗红染色和生化血脂测定的绝对定量，往往不完全匹配，这两种方法产生高重现性，在统计学上显着的结果，同意定性。此外，这种方法可以定制，以满足个别研究人员可能需要进一步分析的单独类别的糖脂，磷脂，甘油三酯的各种样品中存在的具体需求。应该指出的是，其他团体使用的技术THAŇ固相萃取分离脂质类之前GC / MS 22。薄层色谱（TLC）和高压液相色谱（HPLC）超过SPE具有优势的，因为它们可能会对能够更好地分离不同的中性脂肪（ 如 TAG，二酰基甘油，游离脂肪酸，和胆固醇酯）从极性脂质（磷脂酰胆碱，磷脂酰乙醇胺）和乙二醇鞘脂。选择SPE，因为它需要一个最低的起始原料（2500-5000蠕虫），它强调的主要长期能量储存，标签，从而弥补了大部分的中性脂质馏分4，速度快，无需专门的设备或板。应当强调的是，根据标准的混合物，SPE完全分离的TAG从PL的，并且是高度可重复性和可靠的（参见图5A）。虽然脂肪酸甲基酯的定量和分析需要的GC / MS，此设备是常用的，并且如果不是局部，样品可如上生成的，并存储在-80℃下在氮气氛下，直到分析的协作者或商业的GC / MS分析服务被配置。

的的GCMS输出包含上每个脂质种内各脂肪酸的高分辨率数据。这允许确定详细的样本之间的差异相比。作为一个例子，研究者可以决定是否被修改了某些脂肪酸的水平更显着的daf-2，则lpd-3或FASN-1的RNAi对矢量控制比其他丰富。因此，这个非常强大的工具可以提供详细的信息，改变脂质种的丰富的，任何实验操作。

在我们的分析中，我们最常TAG质量标准化PL质量。虽然蛋白质或DNA也可以用于从超声波处理的蠕虫颗粒的等分试样测定后正常化脂质质量，我们发现，这些方法可能会为int在所有的移液步骤，并在每次提取的样品回收率从roduced人为错误。这是因为这个原因，我们选择了我们的归一化因子，而不是使用PL质量。非自然标准都是通过固相萃取的所有步骤进行的，并在开始的协议（tritridecanoin为TAG，1,2-diheptadecanoyl-sn-甘油-3 -磷酸-（1'-rac-甘油）用于PL）引入FAME准备，并保证标记和PL组分的定量和有代表性的恢复。不能作出同样的保证，如果调查使用蛋白或DNA正常化TAG质量。我们相信，PL是最强大的压力表比较TAG样本之间的水平，因为它已被先前的研究显示，PL只有微小的改变，相同的刺激，影响大的质量在TAG水平的变化， 例如扩展饥饿或增加运动34 – 36。 PL被认为扮演一个结构性的作用，保证了膜的流动性和蜂窝电话集成grity和信令的角色，而不是作为能量储存37-39。在我们的手中，的TAG / PL比最紧密的匹配是通过与尼罗红染色固色剂为基础的脂质，并同意与其他组21中发现的。一种替代的策略是使用由瓦特实验室，在那里的百分比计算的脂质文件TAG与总脂质9,22,29相比 。

使用非原生类型的TAG和PL标准，确保没有原生的脂肪酸将被纳入正常化计算。链长度的选择纯粹是根据这些标准的需要，以便不干扰的固有脂肪酸的质谱。我们已经发现，13:0和17:0脂肪酸提供最佳服务这一宗旨。这是可能的，给定的不同的化学性质的短链脂肪酸，我们不自然的脂肪酸标准可能不是代表恢复的所有的链的长度，用diff的脂肪酸或链条erent饱和指数。因此，它是可能的，在SPE或GCMS，我们可能会看到在纯化或脂​​质的不同链长的检测之间的效率差异。根据这和不同的电离电不同的脂肪酸中的GCMS，它是不能够进行绝对的陈述的任何给定的脂肪酸中的丰度。因此，我们只有一个单一的实验样本在任何给定的脂肪酸丰度之间的比较。如果一个人想绝对定量的脂肪酸，1的方式，这可以实现是将运行与上述加有已知量的稳定同位素标记的13 C版本，或类似的脂肪酸制备的样品，因此，它可能是根据质量MSD中的母体离子，例如区分。由于我们只比较相对量的脂质类或任何特定的脂肪酸，我们的13:0的TAG和17:0 PL标准，充分达到这个目的，在最低的成本，以每类脂质保证足够和有代表性的恢复。

直到此时，一直缺乏共识的解释，通过各种方法取得了一定的成绩，和现行的方法应该是什么。整体而言，这应该指出，没有一种方法在隔离非常适合研究C 中的脂肪代谢线虫 。然而，通过使用多个筛选和验证方式，可以实现对脂质调控基因上获得的数据的信心。因此，我们打算为我们的协议为基准，为今后的工作，在该领域的C.线虫脂肪的研究。

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

我们想感谢迈克尔Kacergis，为技术援助和联丰吴的讨论和阅读的手稿。这项工作是支持的职业生涯发展奖由美国国立卫生研究院/ NIDDK（K08DK087941到AAS），NIH / NIDDK训练的授予（5T32DK007028到ECP），埃里森医学基金会的新学术在老化奖（AAS），和查尔斯Ĥ胡德基金会儿童健康研究奖（AAS）。

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments
96-pin replicator Nunc 250520
LB Agar US Biologicals L1500
Agarose Invitrogen 16500500
Mechanical Pipettors Biohit M Line M10, M100, M300
Electronic Pipettor Biohit E Line E1200
1 M KH2PO4 Sigma P0662 pH 6.0 Sterilized by Autoclaving
1 M MgSO4 Sigma M2643 Sterilized by Autoclaving
1 M CaCl2 Sigma C2661 Sterilized by Autoclaving
NaCl Sigma S5886
5 mg/ml Cholesterol Sigma C8667 In 100% Ethanol
200 mg/ml Carbenicillin US Biologicals C1100 Filter Sterilized 0.2 μ
1 M IPTG US Biologicals I8500 Filter Sterilized 0.2 μ
100 mg/ml Ampicillin Filter Sterilized 0.2 μ
5 mg/ml Tetracycline In 100% Ethanol
Bacto Agar BD 214040
96-well TC Plates BD-Falcon 353072 For 96-well RNAi
Rectangular A/T Plates Thermo Scientific 242811 For stamping RNAi
LB Media US Biologicals L1530 Prepared as per manufacturer instructions
96-well Deep Well Assay Blocks Corning Costar 3960 Rectangular V-bottom assay block
96-well Shallow Well Assay Block Corning Costar 3956 Round V-bottom assay block
Sterile Sealing Film VWR 89134-432
Aluminum Sealing Film Corning Costar 6570 Thermowell Sealing tape for 96-well plates
M9 Buffer See Hope et al.20 See recipe below
Triton X-100 Bio-Rad 161-0407
Nile red Invitrogen N-1142
Isopropanol Fisher BP2632-4
96-pin aspirator VP Scientific VP177A-1
96-well Teflon Masked Microscope Slides Thermo Scientific Custom Can also order Trevigen 96-well Cometslide
96-well Gold-Seal Coverslides Thermo Scientific Custom Can also use second 96-well Cometslide
Deep-well PCR plate VWR 89049-178
Non-sterile adhesive film VWR 60941-070
High-Throughput Microscope Leica DM6000 fully automated with Prior 96-well stage With Chroma 49002 GFP filter set and 2x objective
Bath Sonicator Diagenode Bioruptor XL
Chloroform Sigma 366927-4L
Methanol Fisher Optima F456-4
Phospholipid Standard Avanti Polar Lipids 830456P 1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1′-rac-glycerol)
Triglyceride Standard NuChek Prep T-135 tritridecanoin
Wiretrol 50 μl Pipet Fisher 21-176-3A Drummond Scientfic
Acetone Sigma 320110-4L
Sulfuric Acid Fisher A300-500
Hexane Fisher Optima H306-1
SPE Silica Column Thermo Scientific 60108-317 Hypersep SI, 100 mg resin bed
Solid Phase Chromatography Manifold Sigma 57265 Supelco Visiprep 24-DL
Borosilicate Pipets Fisher 13-678-27F 10 ml size
Borosilicate Pasteur Pipets Fisher 13-678-8B
Borosilicate Culture Tubes Fisher 14-961-27
Threaded Borosilicate Tubes VWR 14235-460 8 ml capacity
Phenolic Caps for Culture Tubes Fisher 14-823-211
GC/MS Autosampler Vials Agilent 5188-6592
Caps for Autosampler Vials Agilent 5185-5861
GC/MS Agilent 6890 GC / 5973 MSD Outfitted with a Supelcowax-10 column

Nematode Growth Media (NGM): for 25 96-well RNAi plates, prepare 1 L of NGM:

Reagent Amount
Deionized water 1 L
NaCl 3 g
Agarose 17 g
Bacto peptone 2.5 g
Autoclave liquid cycle 121 °C for 40 min with a stir bar. Allow to cool to 60 °C stirring on a hot plate set at 60 °C. Then add the following:
1 M MgSO4 1 ml
5 mg/ml cholesterol 1 ml
1 M KH2PO4 (pH 6.0) 25 ml
1 M CaCl2 1 ml
200 mg/ml carbenicillin 1 ml
1 M IPTG 5 ml
Dispense into 96-well RNAi plates. Store at 4 °C until use, up to 2 weeks.

Rectangular Ampicillin/Tetracycline LB Agar Plates (A/T): for 20 A/T plates, prepare 1 L of media:

Reagent Amount
Deionized water 1 L
LB agar (US Biologicals) 32 g
2 M NaOH 1.5 ml
Bacto agar 2.5 g
Autoclave liquid cycle 121 °C for 40 min with a stir bar. Allow to cool to 60 °C stirring on a hot plate set at 60 °C. Then add the following:
Tetracycline 3 ml
100 mg/ml Ampicillin 0.5 ml
Dispense 45 ml into each plate. Store in dark at 4 °C until use, up to 4 weeks.

LB bacterial growth media: for 4 L, sufficient for growing and resuspending 25 96-well blocks

Mix 62 g LB powder (US Biologicals), 4 L distilled water, and 4.8 ml 2 M NaOH. Autoclave in 1 L or 0.5 L aliquots, liquid cycle, 40 min. Can be stored up to 1 year in airtight bottles at room temperature. Discard if cloudy.

100 mg/ml Ampicillin

Mix 5 g ampicillin powder and deionized water to a total volume of 50 ml. Filter sterilize 0.2 μ, dispense in 1 ml aliquots and freeze at -20 °C until use.

5 mg/ml Tetracycline

Add 1.25 g tetracycline powder to 250 ml 100% ethanol. Mix well until fully dissolved and store at -20 °C in a light-tight container.

200 mg/ml Carbenicillin

Mix 10 g carbenicillin powder and deionized water to a total volume of 50 ml. Filter sterilize 0.2 μ, dispense in 1 ml aliquots and freeze at -20 °C until use.

5 mg/ml Cholesterol

Add 1.25 g cholesterol to 250 ml 100% ethanol. Mix well and store at 4 °C for up to 6 months.

1 M MgSO4

Dissolve 120.37 g MgSO4 in 800 ml deionized water. Bring final volume to 1 L. Autoclave 40 min liquid cycle and store at room temperature.

1 M CaCl2

Dissolve 110.98 g CaCl2 in 800 ml deionized water. Bring final volume to 1 L. Autoclave 40 min liquid cycle and store at room temperature.

1 M KH2PO4, pH 6.0

Dissolve 136.09 g KH2PO4 in 800 ml deionized water. pH to 6.0 and bring final volume to 1 L. Autoclave 40 min liquid cycle and store at room temperature.

M9 Buffer: for 1 L—we routinely make 8-10 L batches

Dissolve 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4 in 900 ml. Bring final volume to 1 L. Aliquot in 100-500 ml bottles and autoclave 40 min on liquid cycle and store at room temperature.

10 N NaOH

Dissolve 400 g NaOH in 800 ml deionized water, allow to cool and bring to a final volume of 1 L. Store in 50 ml tubes at room temperature.

1 M IPTG

Add 23.81 g IPTG to deionized water and bring total volume to 100 ml. Filter sterilize 0.2 μ, dispense in 1 ml aliquots and freeze at -20 °C until use.

Egg Preparation Bleach/NaOH Solution: 20 ml sufficient for one egg preparation

Add 4 ml bleach, 1 ml 10 N NaOH, 5 ml H2O, and 10 ml M9 buffer to a 50 ml polypropylene conical tube. Make immediately before use.

Nile red stock solution

Add 50 ml 100% Acetone to 25 mg Nile red powder. Mix well and store at room temperature in light-tight parafilmed container. Can be stored for months in this manner.

Nile red staining solution: for 500 ml, sufficient for staining 30 x 96-well plates

Add 3 ml Nile red stock solution to 500 ml 40% v/v isopropanol. Store at room temperature in foil-wrapped glass bottle. Prepare immediately before use.

Phospholipid Standard

Weigh 7.6 mg phospholipid standard, 1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1′-rac-glycerol), in a glass beaker. Dissolve in 20 ml 2:1 chloroform:methanol (25 nanomoles per 50 μl). Keep covered with aluminum foil until use. Standard can also be kept at -80 °C in an airtight glass vial with phenolic cap for 1 year.

Triglyceride Standard

Weigh 6.8 mg triglyceride standard, tritridecanoin, into a glass beaker. Dissolve in 30 ml 2:1 chloroform:methanol (16.7 nanomoles per 50 μl). Keep covered with aluminum foil until use. Standard can also be kept at -80 °C in an airtight glass vial with phenolic cap for 1 year.
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Referencias

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Pino, E. C., Webster, C. M., Carr, C. E., Soukas, A. A. Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans. J. Vis. Exp. (73), e50180, doi:10.3791/50180 (2013).
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