Qui vi presentiamo un metodo istologico per l'acquisizione, l'etichettatura, otticamente compensazione, e di imaging intatto interfaccia tessuto cerebrale intorno microdispositivi cronicamente impiantati nel tessuto cerebrale dei roditori. Risultati dalle tecniche comprendenti questo metodo sono utili per comprendere l'impatto delle varie penetranti cerebrali impianti sul loro tessuto circostante.
La ricerca sulla progettazione e l'utilizzo di microdispositivi cervello-impiantati, ad esempio matrici di microelettrodi, mira a produrre dispositivi clinicamente rilevanti che si interfacciano per lungo tempo con il tessuto cerebrale circostante. Tessuto circostante questi impianti è pensato per reagire alla presenza dei dispositivi nel tempo, che comprende la formazione di un isolante "cicatrice gliale" attorno ai dispositivi. Tuttavia, l'analisi istologica di questi cambiamenti del tessuto viene tipicamente eseguita dopo espianto del dispositivo, in un processo che può disturbare la morfologia del tessuto di interesse.
Qui mostriamo un protocollo in cui sono raccolti corticali-impiantati dispositivi intatto nel circostante tessuto cerebrale dei roditori. Descriviamo come, una volta perfusi con fissativo, cervelli vengono rimossi e tranciato in modo da evitare dispositivi dell'espianto. Abbiamo delineare etichettatura immunofluorescenza e metodi di compensazione ottica utili per la produzione di carattere informativo, ma di spessore del tessutosezione. Infine, dimostriamo il montaggio e immagini di queste sezioni di tessuto al fine di indagare l'interfaccia biologica intorno cerebrali impiantati dispositivi.
Il campo di neuroprosthetic ricerca si propone di aiutare le persone che soffrono di varie disabilità e disturbi bypassando le strutture malate o danneggiate nel corpo attraverso il sistema nervoso centrale di interfacciamento 1,2 dispositivi. Microdispositivi Brain-impiantati, ad esempio matrici di microelettrodi (MEA), può essere utilizzato per registrare o stimolare strutture cerebrali, e permettere così la creazione di interfacce a lungo termine tra l'elettronica e dei tessuti del SNC 3-5. MEA penetranti, i dispositivi che sono conficcati nel tessuto cerebrale, promettenti come interfacce particolare a causa della vicinanza entro il quale essi presentano elettrodi a un insieme relativamente piccolo di neuroni vicini 6 bi-direzionali.
Tuttavia, complesso risultato tessuto risposte dal lungo termine impianto di MEA penetranti, spesso con conseguente variabili e gradualmente degradanti elettrofisiologiche segnale-rumore rapporto più giorni a mesi, e un aumento impedenza elettricazione tra i siti degli elettrodi e la massa 7,8. Le origini putativi di questi cambiamenti includono l'attivazione della microglia, astrocitosi reattiva lungo i microdispositivi, e una perdita di neuroni o migrazione dal tessuto circostante per dispositivi impiantati 9-11. Una sfida importante per la comprensione di questi cambiamenti del tessuto intorno croniche, AAM penetrazione è la difficoltà di acquisizione dei dati istologici dell'interfaccia tessuto intatto circostante dispositivi impiantati cronicamente 12. L'analisi istologica del tessuto con il dispositivo / interfaccia tessuto ancora presente sarebbe migliorare l'attuale dispositivo di rimozione protocolli istologici. Con un dispositivo indisturbata rimanendo nel tessuto, l'effetto biologico di interazioni relativamente sottili, come l'utilizzo di rivestimenti biocompatibili 13,14 o la compensazione elettrica della superficie dell'elettrodo, 15,16 potrebbero essere esposte e analizzati rispetto all'impianto.
Hprima che si dimostra un metodo per raccogliere, elaborare, e l'immagine l'interfaccia microdispositivo intatta per microscopia dettagliata basata su un'analisi del tessuto cerebrale circostante. In questo metodo, il dispositivo e il tessuto cerebrale circostante vengono raccolti in una spessa (> 250 micron) sezione di tessuto utilizzando un vibratomo. Per migliorare la penetrazione istologico etichetta in queste fette spesse, etichette fluorescenti istochimiche ed immunoistochimiche sono applicati in concentrazioni elevate in soluzioni contenenti siero di blocco e detersivo per più giorni. Una soluzione di compensazione ottica viene utilizzato per migliorare la profondità di imaging microscopia, e il tessuto è montato in 2-sided camere per la successiva scansione laser microscopia confocale 17. Per catturare l'interfaccia completa istologico, un computer controllato stadio traslazionale viene utilizzato durante l'imaging per raccogliere Z-stack panorami lungo la lunghezza della protesi. Oltre all'imaging applicare etichette tessuti, raccogliendo riflettanza laser indietro da impiantie la trasmissione della luce attraverso il tessuto sia aiuto localizzare l'interfaccia dispositivo in relazione al tessuto circostante. Tissue redatto utilizzando questo "Device-Capture Istologia" (DCHist) protocollo prevede l'accesso di imaging per le morfologicamente conservati tessuti / dispositivo di interazioni, e migliora così al precedente dispositivo di rimozione protocolli istologici 18.
Il "Device-Capture Istologia" (DCHist) metodo illustrato qui consente la valutazione istologica stretta delle interazioni morfologicamente conservate tra i tessuti cerebrali e impianti di tessuto. Tessuto collezione DCHist richiede un'attenta separazione del cranio montati componenti del dispositivo da componenti impiantati nel cervello. DCHist richiede anche la raccolta di una grossa fetta del tessuto istologico (> 250 micron). Queste sezioni di tessuto, una volta etichettati, eliminato, montato, e con immagini, in grado di fornire nuove intuizioni nel pregiudizio impianto o cronica conseguente risposta ai dispositivi a permanenza. Utilizzando strumenti di microscopia avanzata, l'interfaccia tra il tessuto e il dispositivo può essere ripreso e analizzato in dettaglio alto come mostrato nelle figure 3-5.
Le tecniche presentate nella loro forma attuale si basano sulla capacità di scavare lentamente il Cuffia realizzata in due parti di cemento dentale e Kwik-Sil fino al punto di impianto del dispositivo.Utilizzando cemento dentale che può essere bruciato o rimosso e un elastomero silicone trasparente attraverso cui piccole forbici può essere guidato visivamente grande aiuto nel successo separare il dispositivo impiantato dalle cranio montati componenti. Tentativo di ridurre il dispositivo sotto il cranio e sopra il cervello per raccogliere in situ non è raccomandato, come il cranio montato impianto sarà estratta dal cervello una quantità significativa.
Anche se più sottili, gli impianti più piccoli, come singoli accordi multilaterali gambo di Tecnologie NeuroNexus, sono più suscettibili di DCHist, i principi non sono limitati a gambo singolo dispositivo o matrici di microelettrodi. Raccolta e strategie di imaging sono sostanzialmente applicabili ai dispositivi multi-gambo e grandi impianti come cannule, con i requisiti è che essi devono essere separati da qualsiasi supporto cranio e raccolte all'interno di una sezione di tessuto di spessore. Sebbene gli autori sono focalizzati sulla analisi del tessutocircostanti gli impianti corticali, i dispositivi guidati più in profondità nel cervello potrebbe anche essere raccolte e ripreso. La profondità di inserimento dell'impianto non dovrebbe influenzare la cattura dell'impianto in una fetta fornito il dispositivo non si discosta notevolmente da l'angolo noto di inserimento.
Limitazioni esistono per l'utile applicazione del metodo DCHist. Sezioni di tessuto cerebrale sono difficili da immagine attraverso centinaia di micrometri, soprattutto nelle aree di sostanza bianca, anche se le soluzioni di compensazione ottica può notevolmente migliorare la profondità di imaging in diversi tessuti 21. Per migliorare ulteriormente la profondità di imaging, microscopia a due fotoni di eccitazione può essere impiegato insieme con la compensazione ottica descritta.
Un'altra potenziale limitazione del metodo descritto può essere i metodi specifici immunoistochimica fluorescenti e anticorpi impiegati dai ricercatori. Diffusione passiva spinge in genere l'integrazione di questi marcatori attraverso il tessuto fissoe sui siti di legame dell'antigene. Le concentrazioni finali di lavoro degli anticorpi deve essere determinata dai ricercatori su un caso per caso per massimizzare la penetrazione del marchio, evitando alti livelli di etichettatura sfondo. Etichettatura anticorpo non deve essere variabile tra fette che vengono elaborati in modo identico, ma differenti anticorpi possono variare notevolmente nella loro capacità di penetrare e contrassegnare loro antigene, con alcuni anticorpi facilmente etichettatura antigeni molte centinaia di micrometri profonde e di altri antigeni etichettatura solo decine di micrometri profonda. Descriviamo migliorare questa diffusione applicando etichette anticorpali superiori a concentrazioni tipiche, per più giorni di applicazione, e in una soluzione contenente detergente diluita e bloccando siero. Periodicamente lanciando le fette promuove anche l'etichettatura. Fasi di recupero Antigen e processi di fissaggio alternativi (ad esempio glutaraldeide, forno a microonde, ecc) può essere adatto per antigeni specifici. Anticorpo secondario-fluorochconiugati roma possono variare anche in loro prestazioni etichettatura sezioni spesse, anche se questo non è stato osservato dagli autori con Alexa Fluor etichette da Invitrogen. In alternativa, soggetti animali transgenici che esprimono proteine fluorescenti nei tipi cellulari di interesse può essere utilizzato per evitare problemi con la penetrazione anticorpo etichetta, come molte proteine fluorescenti come eGFP, mantengono la loro fluorescenza dopo trattamento con formaldeide, e può essere immediatamente visualizzata in sezioni di tessuto.
DCHist è un potente insieme di tecniche per catturare e analizzare l'impatto di microdispositivi impiantati sul tessuto cerebrale. Giunto questo protocollo istologico con valutazione in vivo della qualità elettrofisiologia e dati di impedenza elettrodo 22 potrebbe migliorare notevolmente la nostra comprensione delle origini biologiche della variabilità fisiologia e del degrado. Il campo di impiantati dispositivi protesici neurali, in particolare, possono beneficiare il dettaglio DCHist imaging del dispositivo intatto / tessuto di interfaccia per informare ulteriore sviluppo biologicamente neutrali dispositivi MEA.
The authors have nothing to disclose.
Tutti gli esperimenti sono stati fatti sotto la supervisione del Animal Care Purdue e del Comitato uso e il programma degli animali da laboratorio presso la Purdue University.
Questo lavoro è stato patrocinato dalla Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) Microsystems Technology Office (OMT), sotto gli auspici del Dr. Jack W. Judy (jack.judy @ darpa.mil) come parte del programma affidabile tecnologia Neural, attraverso Space and Naval Warfare Systems Command (SPAWAR) Systems Center (SSC) Pacific Grant No N66001-11-1-4013.
Gli autori desiderano ringraziare Mikhail Slipchenko, Don Ready, Greg Richter, Aaron Taylor, e Kevin Eliceiri per condividere la loro esperienza microscopia.
Reagents | |||
Hoechst 33342 | Invitrogen | 14533 | DNA marker |
Rabbit anti-Iba1 | Wako (Japan) | 019-19741 | Monocyte antibody |
Dental acrylic | Lang Dental (various distributors) | Jet Denture Repair Powder & Liquid | Headcap construction |
Kwik-Sil | World Precision Instruments | KWIK-SIL | Covering exposed cranial implants |
Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | Tissue processing |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ml | Tissue processing |
Urea | Sigma-Aldrich | U4883 | Clearing solution |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G20225 | Clearing solution |
Equipment | |||
Curved micro-scissors | World Precision Instruments | 14208 | Cutting implant before removing brain |
Razor blades | Ted Pella | (various sizes) | For use with Brain Block |
Acrylic Brain Matrice | Ted Pella | 15054 | Brain Block to create initial plane in tissue |
Plastic slides | Ted Pella | 260225 | Mounting tissue |
Cover glass | Ted Pella | (various sizes) | Mounting tissue |
Electrode arrays | NeuroNexus Technologies | (various designs) | Example MEAs |
Vibratome | Leica | VT1000 S | Specific system used in presented method |
Vibratome blades | (various suppliers) | Collecting slices | |
24-well plates | (various suppliers) | Storing and processing tissue slices | |
Confocal microscope with motorized XY-scanning stage | Carl Zeiss Microscopy | Zeiss LSM 710 and ‘Zen 2010’ software | Specific system used in presented method |
Soldering iron | (various suppliers) | Excavating headcap |