Isolering och analys av Brain-binds Leukocyter från<em> Plasmodium berghei</em> ANKA-infekterade möss
Summary
En metod för isolering av vidhäftande inflammatoriska leukocyter från fartyg hjärnan blod av<em> Plasmodium berghei</em> ANKA-infekterade möss beskrivs. Metoden medger kvantifiering samt fenotypisk karakterisering av isolerade leukocyter efter färgning med fluorescerande antikroppar och efterföljande analys med flödescytometri.
Abstract
Vi beskriver en metod för isolering och karaktärisering av vidhäftande inflammatoriska celler från fartyg hjärnan blod av P. berghei ANKA-infekterade möss. Infektion av mottagliga mus-stammar med denna parasit stam resulterar i induktion av experimentell cerebral malaria, en neurologisk syndrom som rekapitulerar vissa viktiga aspekter av Plasmodium falciparum-medierad svår malaria hos människor 1,2. Mogna formerna av blod steg malaria uttrycker parasitiska proteiner på ytan av den infekterade erytrocyt, vilket tillåter dem att binda till vaskulära endotelceller. Denna process inducerar hinder i blodflödet, vilket resulterar i hypoxi och blödningar 3 och stimulerar rekryteringen av inflammatoriska leukocyter till stället för parasiten kvarstad.
Till skillnad från andra infektioner, dvs neutrotopic virus 4-6, båda malaria parasiterade röda blodkroppar (pRBC) samt tillhörande Inflammatory leukocyter förblir binds i blodkärlen i stället infiltrera hjärnparenkymet. Således att undvika kontaminering av binds leukocyter med icke-inflammatoriska cirkulerande celler, omfattande intracardial perfusion av infekterade möss före orgel utvinning och vävnad bearbetning krävs denna procedur för att ta bort blodet facket. Efter perfusion är hjärnor skördas och dissekerades i små bitar. Vävnadsstrukturen ytterligare störs av enzymatisk behandling med kollagenas D och DNAs I. Det resulterande hjärnhomogenat sedan centrifugeras på en Percoll-gradient som möjliggör separation av hjärnan binds leukocyter (BSL) från myelin och annan vävnad skräp. Isolerade celler tvättas sedan, räknades med användning av en hemocytometer och färgades med fluorescerande antikroppar för efterföljande analys genom flödescytometri.
Detta förfarande möjliggör omfattande fenotypisk karaktärisering av inflammatoriska leukocyter migrerar till hjärnan i rerespons till olika stimuli, inklusive stroke, liksom virala eller parasitiska infektioner. Metoden ger också ett användbart verktyg för bedömning av nya anti-inflammatoriska behandlingar i prekliniska djurmodeller.
Protocol
Representative Results
Discussion
Isolering och analys av BSL är en metod som möjliggör karakterisering och kvantifiering av inflammatoriska celler migrerar till hjärnan som svar på vävnadsskada eller infektion i experimentella musmodeller. Införandet av en intracardial perfusion steg för avlägsnande av blod facket innan orgel extraktion och efterföljande cellisolering är användbart för att förhindra kontaminering av inflammatoriska celler med icke-inflammatoriska cirkulerande leukocyter. Detta kan inte vara ett viktigt krav i neurotropa i…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka fröken Liana Mackiewicz för tekniskt stöd. Detta arbete har gjorts möjlig genom viktorianska delstatsregeringen driftsinfrastruktur Support och Australiens regering National Health och Medicinska forskningsrådet IRIISS och projektbidrag 1.031.212.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Solutions and buffers | |||
| Giemsa’s azur eosin methylene blue solution | Merck Millipore | 1.09204.0500 | 1:10 dilution in distilled water |
| RPMI medium | Mouse tonicity | ||
| Mouse tonicity PBS | 20 mM Sodium Phosphate, 0.149 NaCl, pH 7.3 | ||
| 0.4%Trypan Blue | Sigma Aldrich | T-8154 | 1:2 dilution |
| Collagenase D | Worthington Biochemical | ||
| Deoxyribonuclease (DNAse) I | Sigma Aldrich | D4263-5VL | From bovine pancreas |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | 30% solution in PBS |
| Ultrapure Tris | Invitrogen | 15505-020 | |
| Ammonium Chloride (NH4Cl) | AnalaR | 10017 | |
| Red Cell Lysis Buffer | 17 mM Tris,14 nM NH4Cl, pH 7.2 | ||
| FCS | Gibco | 1009 | |
| EDTA disodium salt | Merck | 10093.5V | 0.1M, pH 7.2 |
| Antibodies and conjugates | |||
| Anti-mouse CD16/CD32 (Fc Block), clone 2.4G2 | BD Pharmingen | 553142 | 1 μl in 50 μl staining buffer (0.5 mg/50 ml) |
| FITC-anti-mouse CD4, clone H129.19 | BD Pharmingen | 553651 | |
| PE-anti-mouse NK1.1, clone PK136 | BD Pharmingen | 553165 | |
| PerCPCy5.5-anti-mouse CD8, clone 53-6-7 | BD Pharmingen | 551162 | |
| APC-anti-mouse TCR-β, clone H57-597 | BD Pharmingen | 553174 | |
| PE-anti-mouse CXCR3, clone 220803 | R&D Systems | FAB1685P | |
| Biotinylated-anti-mouse CCR5, clone C34-3448 | BD Pharmingen | 559922 | |
| Steptavidin-PerCP-Cy5.5 | BD Pharmingen | 551419 | |
| Equipment and material | |||
| SuperFrost microscope slide | Lomb Menzel-Gläser | ||
| Dissection forceps, scissors | REDA Instrumente | ||
| 500 ml PBS reservoir | Nalgene | ||
| Rubber tubing | |||
| 23G needle | BD PrecisionGlide | 302008 | |
| Cell dissociation kit containing metal sieve | Sigma Aldrich | CD-1 | |
| 70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| Hemocytometer | GmbH Neubauer | 717810 | |
| Flow cytometry tubes | BD Falcon | 352008 |
Referencias
- Brian de Souza, J., Riley, E. M. Cerebral malaria: the contribution of studies in animal models to our understanding of immunopathogenesis. Microbes and Infection. 4, 291-300 (2002).
- Schofield, L., Grau, G. E. Immunological processes in malaria pathogenesis. Nature. 5, 722-735 (2005).
- Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. The pathogenic basis of malaria. Nature. 415, 673-679 (2002).
- Howe, C. L., Lafrance-Corey, R. G., Sundsbak, R. S., Lafrance, S. J. Inflammatory monocytes damage the hippocampus during acute picornavirus infection of the brain. Journal of neuroinflammation. 9, 50 (2012).
- LaFrance-Corey, R. G., Howe, C. L. Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes. J. Vis. Exp. (52), e2747 (2011).
- Lim, S. M., Koraka, P., Osterhaus, A. D., Martina, B. E. West Nile virus: immunity and pathogenesis. Viruses. 3, 811-828 (2011).
- Belnoue, E., et al. On the pathogenic role of brain-sequestered alphabeta CD8+ T cells in experimental cerebral malaria. Journal of Immunology. 169, 6369-6375 (2002).
- Campanella, G. S., et al. Chemokine receptor CXCR3 and its ligands CXCL9 and CXCL10 are required for the development of murine cerebral malaria. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 105, 4814-4819 (2008).
- Hansen, D. S., Bernard, N. J., Nie, C. Q., Schofield, L. NK cells stimulate recruitment of CXCR3+ T cells to the brain during Plasmodium berghei-mediated cerebral malaria. Journal of Immunology. 178, 5779-5788 (2007).
- Amante, F. H., et al. A role for natural regulatory T cells in the pathogenesis of experimental cerebral malaria. The American journal of pathology. 171, 548-559 (2007).
- Nie, C. Q., et al. IP-10-mediated T cell homing promotes cerebral inflammation over splenic immunity to malaria infection. PLoS pathogens. 5, e1000369 (2009).
- Franke-Fayard, B., et al. Murine malaria parasite sequestration: CD36 is the major receptor, but cerebral pathology is unlinked to sequestration. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 11468-11473 (2005).
- Nitcheu, J., et al. Perforin-dependent brain-infiltrating cytotoxic CD8+ T lymphocytes mediate experimental cerebral malaria pathogenesis. Journal of Immunololgy. 170, 2221-2228 (2003).
- Lundie, R. J., et al. Blood-stage Plasmodium infection induces CD8+ T lymphocytes to parasite-expressed antigens, largely regulated by CD8alpha+ dendritic cells. Proceeding of the National Academy of Science U S A. 105, 14509-14514 (2008).
