Drosophila Adulto olfativa Choque Aprendizaje

1. Preparación Fly Outcross todos los mutantes, Gal4 / UAS y otras líneas con una cepa de tipo salvaje, como CSw-, durante al menos seis generaciones antes de los experimentos de comportamiento para controlar para el fondo genético 26. Crecer moscas en una dieta estándar de alimentos de harina de maíz, la levadura y la melaza en un ciclo de luz-oscuridad de 12:12 horas a 25 ° C, a menos manipulaciones específicas requieren una temperatura diferente. Para determinar los efectos de la expresión transgénica: Uso 18 ° C para evitar la expresión de transgenes en (TARGET) Gal4 GAL80 ct a través de desarrollo y luego pasar las moscas a una incubadora a 30 ° 1-2 días antes del experimento conductual. Llevar a cabo el experimento a 30 ° C para determinar los efectos de la expresión del transgen 3,4,6,7,14. Para los experimentos que utilizan canales TRPA1 activados por calor para estimular las neuronas: Levante las moscas a 23 ° C, que es una temperatura conocidapara mantener un canal inactivo, y luego cambiar a una habitación comportamiento a 30 ° C para activar el TRPA1 neuronas que expresan. Para experimentos con temperatura Shibire sensibles a bloquear la salida sináptica 11, 14,24: Rear las moscas a 18 ° C y realizar pruebas a 30 ° C. Recoge las moscas 1-2 días antes del experimento y contarlos en grupos de aproximadamente 25 bajo CO 2 anestesia ligera. Guarde las moscas por lo menos S / N en frascos de comida (sin levadura) a 25 ° C (a menos manipulaciones específicas requieren una temperatura diferente) y una humedad relativa del 70% en una sala de ambiente controlado con luz 12:12 hr: condiciones de oscuridad hasta el momento del experimento. Nota: Este almacenamiento permite que las moscas se aclimaten a prueba el aprendizaje posterior realizado en la sala de ambiente controlado, que tenía las condiciones óptimas para el aprendizaje Drosophila y, sobre todo, elimina cualquier envi diariavariaciones ambientales que podrían haber afectado el fenotipo conductual. 2. Preparación antes del experimento Lleve a cabo los experimentos en un plexiglás T-laberinto a medida (Figura 1). Compruebe regularmente el tubo de ajuste para asegurar que se obtiene un sello hermético durante el experimento. Si es necesario, cambiar las juntas tóricas que sellan los compartimentos en el interior de la T-laberinto. Coloque rejillas de cobre a la medida interior de los tubos de formación. Revise y limpie estas rejillas regularmente, y reemplazar si es oxidado. Coloque las rejillas de cobre a través de cables de pinzas de cocodrilo que se ejecutan a una caja de interruptor conectado a un estimulador eléctrico. Utilice un voltímetro para asegurarse de que el aparato está entregando el shock necesario. Utilizar G-abrazaderas para sujetar firmemente el laberinto para evitar cualquier fuga de aire. Conecte el laberinto en T a un tubo que corre a una bomba de aire, para permitir que los olores que se pueden extraer a través de las moscas y posteriormente retirados de la T-laberinto. Mantener el aire levefluir a ~ 2 L / min 3. Olor diluciones Use dos olores diferentes en concentraciones tales que las moscas muestran una preferencia igual para ambos olores. Utilice 4-metilciclohexanol (1:67) y 3-octanol (1: 100) diluido en aceite mineral 7,13. Nota: Determine cuidadosamente estas concentraciones, que variarán por el laboratorio. Por ejemplo otros utilizan 1:10 para ambos olores 24. Otros olores comúnmente usados ​​incluyen acetato de etilo y acetato de iso-amilo. Pipetear 30 l de la olor diluido en una taza de olor a medida colocado en un bloque de olor cubierto por un tubo de plástico con una tapa perforada que permite que el aire sea aspirado en el olor en la copa, exponiendo así las moscas a un penacho de olor. 4. protocolo de entrenamiento (Figuras 1 y 2) Para el adulto choque acondicionado olfativa, realizar todos los experimentos bajo una tenue luz roja (es decir., LED rojo), lo que permite al investigador ver pero impide que el fly de ver, permitiendo así que las moscas se concentren en el olfato en contraposición a las entradas visuales. Introducir las moscas en el tubo de entrenamiento y luego adjuntar a la T-laberinto y les permiten adaptarse al tubo y el flujo de aire durante 90 segundos. Presentar el primer olor (4-metilciclohexanol, MCH) con un choque de 60 V (que consta de doce pulsos 1.25 segundos con intervalos entre pulsos 3,75 seg) para una duración total de 60 segundos. Siga el choque con un periodo de descanso de 30 segundos sin un olor o una descarga. Presentar el segundo olor (3-octanol, OCT) durante 60 segundos sin un shock. Siga el choque con un periodo de descanso de 30 segundos sin un olor o una descarga. Mueva las moscas de la cámara de la formación en la cámara central de la T-laberinto girando el laberinto en T en su lado y suavemente golpeando el fondo del laberinto en T en una superficie blanda, como una vieja estera del ratón. Mantener las moscas en la cámara central durante 90 segundos. Montar los tubos de elección en el bottom del aparato para formar el laberinto en T. Para medir el aprendizaje, mover las moscas hasta el punto de la T-laberinto, donde fueron expuestos simultáneamente a los dos olores elección y avanzar hacia una. Llevar a cabo un período de prueba durante 120 segundos. Trampa las moscas en los tubos de elección deslizando la cámara central de este modo hasta el bloqueo de los extremos de los tubos de elección. Recoger las moscas en cada brazo del laberinto en T y en el compartimiento central en viales de alimentos y recuento. Para medir la memoria, recoger las moscas después de la formación (4.6) y transferirlos desde el laberinto en T a viales de alimentos sin levadura. Tienda vuela en la oscuridad a 25 ° C y 70% de humedad durante el tiempo necesario restante para determinar la fase de la memoria de interés (véase la introducción). Reintroducir las moscas a la T-laberinto como en la etapa 4.7. Para la memoria a largo plazo, utilice un laberinto a la medida que permite a varios lotes de moscas para ser entrenados de forma simultánea. Administrar 5 ciclos de formación con un 15 min entre ciclos intervalo (spaced) o sin un intervalo entre ciclos (masivo). Mantener las moscas a 18 ° C y 70% de humedad en la oscuridad hasta que las pruebas. Antes de la prueba, mover las moscas a 25 ° C y deje que se aclimaten durante al menos 1 hora. Evaluar la memoria a largo plazo 24 horas después del entrenamiento. Después de los experimentos de comportamiento, limpiar las tazas de olor con agua caliente y detergente sin olor. Después del secado, capa las tazas con 10 l Sigmacote. Secar la Sigmacote por calentamiento en un horno de microondas. De vez en cuando limpie el laberinto en T de tubos de metacrilato y bloques de olor con agua caliente y detergente sin olor. 5. Cálculo del Índice de Rendimiento: una medida de la memoria de las moscas Calcular el Índice de Rendimiento (PI) para cada condición como el número de moscas evitando el olor de choque-emparejado (CS -) menos el número de moscas que eligen el olor de choque-emparejado (CS +) dividido por el número total de moscas (CS – + CS +) 1. PeÍndice rformance (PI) = (# CS – vuela – # CS + vuela) / (# total de moscas) Calcular la PI final del experimento promediando la PI del experimento en el que MCH era el olor de choque-emparejado y uno en el que la tomografía óptica fue el olor de choque-emparejado. Esto elimina cualquier sesgo de las moscas que tienen una mayor preferencia por un olor. 6. Controles sensoriomotora Realizar olor agudeza introduciendo ~ 40-50 moscas en el laberinto en T 6,7,17. Después de 90 segundos, mueva las moscas hasta el punto de elección, y les permitirá a 2 min de elegir entre los olores puros y aire. Recoger y contar las moscas. Calcular el porcentaje de evitación dividiendo el número total de moscas que optaron por el olor de los que participaron en la prueba. Para sorpresa reactividad 6,7,17, introducir las moscas en la cámara de descarga. Después de 90 segundos de descanso, administrar una descarga eléctrica de 60 V DC, de la que las moscas pueden escapar a un semejantetubo sin un shock. Permita 2 min para las moscas para elegir; recoger y contar las moscas. Calcular el porcentaje evitación de shock dividiendo el número de moscas que evitaron el choque escapando el tubo de choque por el número total de moscas en el experimento. Incluya las moscas que permanecen en la cámara central en el total de los que escaparon de la descarga eléctrica.