Drosophila adulti olfattiva Shock Learning

1. Fly Preparazione Outcross tutti i mutanti, Gal4 / UAS ed altre linee con un ceppo di tipo selvatico, come CSw-, per almeno sei generazioni prima degli esperimenti comportamentali per il controllo di background genetico 26. Crescere mosche su una farina di mais, lievito e melassa cibo dieta standard nell'ambito di un ciclo luce-buio 00:12 ore a 25 ° C, a meno manipolazioni specifiche richiedono una temperatura diversa. Per determinare gli effetti di espressione del transgene: Usa 18 ° C per impedire l'espressione di transgeni in (sistema TARGET) Gal4 Gal80 ts attraverso lo sviluppo e quindi spostare le mosche per un incubatore a 30 ° C 1-2 giorni prima che l'esperimento comportamentale. Condurre l'esperimento a 30 ° C per determinare gli effetti di espressione del transgene 3,4,6,7,14. Per gli esperimenti che utilizzano i canali TRPA1-attivati ​​dal calore per stimolare i neuroni: Sollevare linea a 23 ° C, che è una temperatura notamantenere un canale inattivo, e poi passare a una camera comportamento a 30 ° C per attivare la TRPA1 esprimendo neuroni. Per gli esperimenti che utilizzano temperature Shibire sensibile di bloccare l'uscita sinaptica 11, 14,24: posteriore linea a 18 ° C e condurre test a 30 ° C. Raccogliere le mosche 1-2 giorni prima dell'esperimento e le considero in gruppi di circa 25 sotto la luce di CO 2 l'anestesia. Conservare le mosche almeno O / N in fiale alimentari (senza lievito) a 25 ° C (a meno manipolazioni specifiche necessarie una temperatura diversa) e umidità relativa del 70% in una stanza con la luce ambiente controllato 00:12 hr: condizioni di buio fino al momento dell'esperimento. Nota: Questo deposito consente in linea di raggiungere la prova di apprendimento successivo effettuato nella stanza ambiente controllato, che aveva le condizioni ottimali per l'apprendimento Drosophila e, soprattutto, elimina ogni queto quotidianovariazioni ambien- che potrebbero essere colpiti fenotipo comportamentale. 2 Preparazione prima dell'esperimento Eseguire gli esperimenti in perspex T-labirinto su misura (Figura 1). Controllare regolarmente il raccordo al fine di garantire una chiusura ermetica che si ottiene durante l'esperimento tubo. Se necessario, cambiare gli O-ring che sigillano i compartimenti interni della T-labirinto. Posizionare le griglie di rame su misura all'interno dei tubi di formazione. Controllare e pulire le griglie regolarmente, e sostituire se ossidato. Fissare le griglie di rame a fili con clip a coccodrillo che corrono a uno switch-box collegato ad uno stimolatore elettrico. Utilizzare un voltmetro per assicurarsi che l'apparecchio sta erogando la scossa necessaria. Utilizzare g-morsetti per tenere il labirinto saldamente per evitare perdite di aria. Collegare il T-labirinto di tubi che corre ad una pompa ad aria, per consentire gli odori da trarre attraverso le mosche e successivamente rimossi dal T-labirinto. Mantenere l'aria miteportata a ~ 2 L / min 3. Odore diluizioni Utilizzare due odori differenti a concentrazioni tali che le mosche mostrano una preferenza uguale per entrambi gli odori. Utilizzare 4-METILCICLOESANOLO (1:67) e 3-ottanolo (1: 100) diluito in olio minerale 7,13. Nota: determinare accuratamente queste concentrazioni, che variano da laboratorio. Ad esempio, altri usano 01:10 per entrambi gli odori 24. Altri odori comunemente usati includono acetato di etile e acetato di iso-amile. Pipettare 30 ml di odore diluito in una tazza odore misura collocato in un blocco odore coperto da un tubo di plastica con una parte superiore forata che permette all'aria di essere disegnato sopra l'odore nella tazza, esponendo così le mosche per un pennacchio odore. 4. Formazione Protocol (figure 1 e 2) Per l'adulto olfattiva scossa condizionata, effettuare tutti gli esperimenti sotto una luce rossa fioca (es., LED rosso), che consente al ricercatore di vedere, ma impedisce la fly da vedere, permettendo così in linea di concentrarsi sul olfatto al contrario di input visivi. Introdurre le mosche nel tubo di formazione e poi allegare alla T-labirinto e consentire loro di adattarsi al tubo e flusso d'aria per 90 secondi. Presentare il primo odore (4-METILCICLOESANOLO, MCH), con una scossa di 60 V (composto da dodici impulsi di 1,25 sec con intervalli tra impulsi 3.75 sec) per una durata complessiva di 60 sec. Seguire lo shock con un periodo di riposo di 30 secondi, senza un odore o scosse. Presentare il secondo odore (3-ottanolo, OCT) per 60 sec senza scosse. Seguire lo shock con un periodo di riposo di 30 secondi, senza un odore o scosse. Spostare linea dalla camera di addestramento nella camera centrale del T-labirinto ruotando il T-labirinto su un lato e delicatamente sbattere fondo del T-labirinto su una superficie morbida come un vecchio tappetino mouse. Mantenere le mosche nella camera centrale per 90 secondi. Montare i tubi di scelta nel bottom dell'apparato per formare il T-labirinto. Per misurare l'apprendimento, spostare le mosche al punto di scelta del T-labirinto, dove sono stati esposti contemporaneamente ad entrambi gli odori e muoversi verso uno. Eseguire un periodo di prova per 120 sec. Trappola linea nei tubi scelta facendo scorrere la camera centrale fino in tal modo bloccando le estremità dei tubi di scelta. Raccogliere le mosche in ogni braccio della T-labirinto e nel vano centrale in fiale alimentari e conteggio. Per misurare la memoria, raccogliere le mosche dopo l'allenamento (4.6) e trasferirli dal T-labirinto per fiale alimentari senza lievito. Conservare vola al buio a 25 ° C e 70% di umidità per il tempo necessario rimanente per determinare la fase memoria di interesse (vedi introduzione). Reintrodurre le mosche al T-labirinto come in fase 4.7. Per la memoria a lungo termine, utilizzare un labirinto costruito su misura che consente a numerosi lotti di mosche per essere formati contemporaneamente. Somministrare 5 cicli di formazione con un 15 min inter-ciclo intervallo (spaced) o senza un intervallo inter-ciclo (ammassate). Mantenere in linea a 18 ° C e 70% di umidità nel buio fino a prova. Prima della prova, spostare le mosche a 25 ° C e consentire loro di acclimatare per almeno 1 ora. Valutare memoria a lungo termine 24 ore dopo l'allenamento. Dopo gli esperimenti comportamentali, pulire le tazze odore con acqua calda e detersivo inodore. Dopo l'essiccazione, cappotto le tazze con 10 microlitri Sigmacote. Essiccare il Sigmacote mediante riscaldamento in un forno a microonde. Di tanto in tanto pulire il T-labirinto in perspex tubi e blocchi odore con acqua calda e detersivo inodore. 5 Calcolo del Performance Index: una misura della Memoria delle mosche " Calcolare il Performance Index (PI) per ogni condizione, come il numero di mosche evitando l'odore shock accoppiati (CS -) meno il numero di mosche che scelgono l'odore shock accoppiati (CS +) diviso per il numero totale di mosche (CS – + + CS) 1. PeIndice rformance (PI) = (# CS – vola – # CS + aria) / (# mosche totali) Calcolare il PI finale dell'esperimento la media della PI dell'esperimento in cui MCH era l'odore shock associato e quello in cui ottobre è stato l'odore di shock-accoppiato. Ciò elimina ogni distorsione delle mosche che hanno una maggiore preferenza per un odore. 6. Controlli sensomotoria Eseguire odore acutezza introducendo ~ 40-50 mosche nel T-labirinto 6,7,17. Dopo 90 sec, spostare le mosche al punto di scelta, e permettere loro 2 min di scegliere tra odori puri e aria. Raccogliere e contare le mosche. Calcolare la percentuale di evasione dividendo il numero totale di mosche che hanno scelto l'odore da parte di coloro che hanno partecipato alla prova. Per urti reattività 6,7,17, introdurre le mosche nella camera di shock. Dopo 90 secondi di riposo, somministrare una scossa elettrica di 60 V DC, da cui le mosche possono sfuggire a una similetubo senza shock. Lasciare 2 min per le mosche di scegliere; raccogliere e contare le mosche. Calcolare la percentuale di shock evitare dividendo il numero di mosche che evitare lo shock da sfuggire al tubo d'urto per il numero totale di mosche in dell'esperimento. Includere le mosche che rimangono nella camera centrale del totale di coloro che sfuggiva la scossa elettrica.