Drosophila Adult Olfactory Shock Learning

1 Fly Voorbereiding Outcross alle mutanten, Gal4 / UAS en andere lijnen met een wildtype stam, zoals CSw-, ten minste zes generaties vóór de gedragsexperimenten te controleren voor genetische achtergrond 26. Kweek vliegen op een standaard maïsmeel, gist en melasse dieet onder een 00:12 uur licht-donker cyclus bij 25 ° C tenzij specifieke manipulaties vereisen een andere temperatuur. Om de effecten van transgene expressie bepalen: Gebruik 18 ° C om de expressie van transgenen in Gal4 GAL80 ts (TARGET-systeem) door middel van ontwikkeling te voorkomen en vervolgens naar de vliegen tot een 30 ° C incubator 1-2 dagen voor de gedrags-experiment. Uitvoeren van het experiment bij 30 ° C om de effecten van transgene expressie 3,4,6,7,14 bepalen. Voor experimenten met warm geactiveerde TRPA1 kanalen neuronen stimuleert Til de vliegen bij 23 ° C, hetgeen een temperatuur bekendeen inactieve kanaal behouden en vervolgens verschuiven naar een gedrag kamer bij 30 ° C om de TRPA1 expressie neuronen activeren. Voor experimenten met Shibire temperatuur gevoelig voor synaptische uitgang 11, 14,24 blokkeren: Achter de vliegen bij 18 ° C en uit te voeren testen bij 30 ° C. Verzamel de vliegen 1-2 dagen voor het experiment en tel ze in groepen van ongeveer 25 onder lichte CO 2 anesthesie. Bewaar de vliegen tenminste O / N in levensmiddelen flacons (zonder gist) bij 25 ° C (tenzij er specifieke manipulaties vereist een andere temperatuur) en 70% relatieve vochtigheid in een milieuvriendelijke gecontroleerde ruimte met 00:12 uur licht: donker totdat de tijd van het experiment. Opmerking: Deze opslag laat de vliegen om te acclimatiseren aan het verder leren-test uitgevoerd in de milieuvriendelijke gecontroleerde ruimte, die de optimale omstandigheden voor Drosophila leren had en, belangrijker nog, verwijdert alle dagelijkse ENVIronmental variaties die de gedragsfenotype zou hebben beïnvloed. 2 Voorbereiding voor het experiment Voer de experimenten in een maat Perspex T-doolhof (figuur 1). Controleer regelmatig de buis aanbrengen om ervoor te zorgen dat een luchtdichte afdichting wordt verkregen tijdens het experiment. Wijzig indien nodig de O-ringen die de compartimenten van de T-doolhof te dichten. Plaats op maat gemaakte koperen roosters in de training buizen. Controleer en reinig deze netten regelmatig en vervang deze indien geoxideerd. Bevestig de koperen roosters draden via krokodillebekken die lopen een schakelkast verbonden met een elektrische stimulator. Gebruik een voltmeter om te waarborgen dat de inrichting de verlangde shock. Gebruik G-klemmen om het doolhof stevig vasthouden om de lucht lekkage te voorkomen. Bevestig de T-doolhof aan buizen die loopt op een luchtpomp, zodat geuren over de vliegen aan te trekken en vervolgens van de T-doolhof verwijderd. Onderhouden milde luchtvloei bij ~ 2 L / min 3 Geur verdunningen Gebruik twee verschillende geuren in concentraties zodanig dat de vliegen tonen een gelijke voorkeur beide geuren. Gebruik 4-methylcyclohexanol (1:67) en 3-octanol (1: 100) verdund in minerale olie 7,13. Let op: bepaal zorgvuldig deze concentraties, die verschillen per laboratorium. Bijvoorbeeld anderen gebruiken 01:10 beide geuren 24. Andere veel gebruikte geuren omvatten ethylacetaat en iso-amyl acetaat. Pipetteer 30 ul van de verdunde geur een maat geur cup geplaatst in een geur blok onder een plastic buis met een geperforeerde top waarmee lucht via geur in de beker te trekken, waardoor de vliegen blootstellen aan een geur pluim. 4 Training Protocol (figuren 1 en 2) Voor volwassen olfactorische shock conditionering, presteren alle experimenten onder een gedimd rood licht (dwz., Rode LED), die het mogelijk maakt de onderzoeker om te zien, maar voorkomt dat de fly van het zien, waardoor de vliegen te concentreren op reukzin tegenover visuele inputs. Introduceren de vliegen in de opleiding buis en dan hechten aan de T-doolhof en hen in staat stellen zich aan te passen aan de buis en de luchtstroom gedurende 90 sec. Presenteer de eerste geur (4-methylcyclohexanol, MCH) met een 60-V shock (bestaande uit twaalf 1.25 sec pulsen met 3.75 sec inter-puls interval) voor een totale duur van 60 sec. Volg de schok met een 30 seconden rustperiode zonder geur of shock. Presenteer de tweede geur (3-octanol, oktober) gedurende 60 seconden zonder een schok. Volg de schok met een 30 seconden rustperiode zonder geur of shock. Beweeg de vliegen van de training kamer in de centrale kamer van het T-doolhof door de T-doolhof op zijn kant en voorzichtig slaande de onderkant van het T-doolhof op een zachte ondergrond zoals een oude muis mat. Handhaaf de vliegen in de centrale kamer voor 90 sec. Bevestig de keuze buizen in de bottom van de inrichting op de T-labyrint vormen. Om het leren te meten, verplaatsen de vliegen om de keuze van het T-doolhof, waar ze tegelijkertijd werden blootgesteld aan zowel de geuren en de stap naar een. Voer een testperiode van 120 sec. Trap de vliegen in de keuze buizen door omhoog schuiven van de centrale kamer waardoor het blokkeren van de uiteinden van de buizen keuze. Verzamel de vliegen in elke arm van het T-doolhof en in het centrale compartiment in voedsel flesjes en tellen. Om het geheugen te meten, verzamelen de vliegen na de training (4,6) en over te brengen van de T-doolhof om voedsel flacons zonder gist. WINKEL vliegt in het donker bij 25 ° C en 70% vochtigheid gedurende de resterende tijd die nodig is om het geheugen fase plaats bepalen (zie inleiding). Opnieuw de vliegen de T-doolhof als in stap 4.7. Voor de lange-termijn geheugen, gebruik dan een op maat gebouwde doolhof die het mogelijk maakt verschillende batches van vliegen tegelijk worden opgeleid. Dien 5 cycli van de opleiding met een 15 min inter-cyclus interval (spaCED) of zonder een inter-cyclus interval (massale). Handhaaf de vliegen bij 18 ° C en 70% vochtigheid in het donker totdat de tests. Voorafgaand aan het testen, bewegen de vliegen tot 25 ° C en laat ze acclimatiseren voor minstens 1 uur. Beoordelen op lange termijn geheugen 24 uur na de training. Na de gedragsexperimenten, het reinigen van de geur kopjes met heet water en reukloos wasmiddel. Na het drogen, de vacht van de cups met 10 ul Sigmacote. Droog de Sigmacote door verwarmen in een magnetron. Af en toe reinigen van de T-doolhof perspex buizen en geur blokken met warm water en reukloos wasmiddel. 5 Berekening van de Performance Index: een maatstaf voor Memory the Flies ' Bereken de-index (PI) voor elke conditie als het aantal vliegen vermijden van de shock-gepaarde geur (CS -) minus het aantal vliegen de keuze-shock gepaarde geur (CS +) gedeeld door het totale aantal vliegen (CS – + CS +) 1. Performance index (PI) = (# CS – vliegt – # CS + vliegt) / (# totaal vliegen) Bereken de laatste PI van het experiment door het middelen van de PI van het experiment waarin MCH was-shock gepaard geur en een waarin oktober was-shock gepaard geur. Dit verwijdert alle vooringenomenheid van de vliegen met een grotere voorkeur voor een geur. 6 Sensomotorische Controls Voeren geur scherpte door de invoering van ~ 40-50 vliegen in de T-doolhof 6,7,17. Na 90 sec, bewegen de vliegen om de keuze punt, en laat ze 2 minuten om te kiezen tussen pure geuren en lucht. Verzamelen en tel de vliegen. Bereken het percentage vermijden door het totaal aantal vliegen die de geur gekozen door degenen die aan de test. Voor shock reactiviteit 6,7,17, introduceren de vliegen in de shock kamer. Na 90 seconden rust, bestuurt een 60 V DC elektrische schok, waarvan de vliegen kan ontsnappen naar een soortgelijkebuisje zonder een schok. Laat 2 min voor de vliegen om uit te kiezen; verzamelen en tel de vliegen. Bereken het percentage shock voorkomen door het aantal vliegen die de schok voorkomen door te ontsnappen aan de schokbuis door het totale aantal vliegen in het experiment verdelen. Neem de vliegen die nog in de centrale kamer van het totaal van die elektrische schok ontsnapt.