Isolierung und Kultivierung von Muskelfasern ist der Goldstandard<em> In vitro</em> System, um den Übergang von Satellitenzellen über quiescence, Aktivierung und Differenzierung zu studieren. Wichtig ist, bewahrt die einzelnen myofiber Kultursystem die myofiber / Stammzell-Vereinigung, die ein wesentlicher Bestandteil des Muskels Stammzellnische ist.
Muscle Regeneration im adulten wird von ansässigen Stammzellen genannt Satelliten-Zellen durchgeführt. Satelliten-Zellen zeichnen sich durch ihre Position zwischen der Basallamina und der Sarkolemm jedes myofiber definiert. Aktuelle Kenntnisse über ihr Verhalten in hohem Maße von der Nutzung der einheitlichen myofiber Trennung Protokoll. Im Jahr 1985 beschrieben Bischoff ein Protokoll, um einzelne lebende Fasern vom Flexor digitorum brevis (FDB) von erwachsenen Ratten mit dem Ziel, ein in vitro-System, in dem die physikalische Verbindung zwischen dem myofiber und dessen Stammzellen 1 erhalten bleibt erstellen isolieren. In 1995, die Bischoff Protokoll, so dass Muskelfasern werden einzeln aufgenommen und separat nach Kollagenaseverdau anstatt von Schwerkraftsedimentation 2, 3 getrennt gehandhabt Rosenblattmodified. Das Rosenblatt oder Bischoff-Protokoll ist seitdem auf verschiedene Muskeln, des Alters oder Bedingungen 3-6 angepasst. Die einzigen myofiber Trennung Technik ist ein unverzichtbaresTool aufgrund seiner einzigartigen Vorteile. Zuerst wird in dem einzigen myofiber Protokoll sind Satellitenzellen unterhalb der Basalmembran beibehalten. Dies ist ein einzigartiges Merkmal des Protokolls als andere Techniken wie Fluorescence Activated Cell Sorting chemische und mechanische Gewebedissoziation 7 erfordern. Obwohl die myofiber Kultur kann nicht für in vivo Studien zu ersetzen, bietet es eine hervorragende Plattform, um relevante biologische Eigenschaften von Muskel-Stammzellen befassen. Einzel Muskelfasern kann in Standard Plattierungsbedingungen oder schwimmende Bedingungen kultiviert werden. Satelliten-Zellen auf schwimmenden Muskelfasern sind kaum ein anderer Einfluss als die myofiber Umgebung ausgesetzt. Substrat Steifigkeit und Überzüge erwiesen sich Satelliten Zellen die Fähigkeit zur Muskeln 8, 9 regenerieren so zu beeinflussen, in der Lage zu jeder dieser Faktoren steuern unabhängig ermöglicht Diskriminierung zwischen nischenartigen abhängige und unabhängige Reaktionen. Verschiedene Konzentrationen von Serum habenAuch wurde gezeigt, dass eine Wirkung auf den Übergang von der Aktivierung quiescence haben. Um die Ruhe Zustand des zugehörigen Satelliten-Zellen zu erhalten, sollten Fasern in niedrigen Serum-Medium 1-3 gehalten werden. Dies ist besonders nützlich, wenn das Studium Gene in der Ruhephase involviert Zustand. Im Serum Vollmedium, Satelliten-Zellen schnell zu aktivieren, vermehren, zu migrieren und zu differenzieren, so imitiert die in vivo regenerativen Prozess 1-3. Das System kann verwendet werden, um eine Vielzahl von Assays, wie die Prüfung chemischer Inhibitoren durchzuführen; ektopische Expression von Genen, die durch Viren Lieferung; Oligonukleotid basierte Gen-Knock-Down-oder Live-Bildgebung. Dieses Video Artikel beschreibt das Protokoll derzeit in unserem Labor verwendet, um einzelne Muskelfasern vom extensor digitorum longus (EDL) Muskeln von erwachsenen Mäusen (6-8 Wochen alt) zu isolieren.
Die Isolierung und Kultivierung von einzelnen Muskelfasern aus intakten Muskeln eine ausgezeichnete in vitro-Modell, um den Prozess der Muskelregeneration studieren. Ein einzigartiges Merkmal dieses Systems ist die Erhaltung der Satelliten-Zellen in ihrer physiologischen Umgebung unterhalb der Basallamina. Vor allem aber können die Technik verwendet, um Muskeln Stammzellverhaltens sowohl Ruhe und aktivierten Zustände zu untersuchen. In den vergangenen 20 Jahren hat sich die myofiber Kultursystem aussagekräftige Einblicke in die Biologie des Satelliten-Zell-Population, die mit Bezug auf die beiden inneren und äußeren Determinanten. Durch Kultivierung einzelnen Muskelfasern, hat Satelliten-Zell-Heterogenität in Bezug auf myofiber, Muskel-Typ oder regenerative Potenzial wurde 15 gerichtet. Aufwändige Untersuchungen mit Live-Bildgebung von einzelnen kultivierten Fasern für die Einholung von Informationen über Satellit Zellmigration Muster 16 erlaubt. Der Erwerb von quantitativen Daten ist einelso möglich. Obwohl zeitaufwendig, bietet es wichtige Informationen über die Verteilung und das Auftreten von bestimmten Ereignissen (Stammzellen asymmetrische Teilung, Vermehrung und Differenzierung Verhältnis, etc.). Zusammen mit den zuvor beschriebenen Anwendungen ist Protein oder RNA-Extraktion aus Einzelfasern auch möglich, obwohl Isolierung reiner Population von Zellen durch FACS Satelliten oder andere Mittel eine bessere Plattform zu Protein oder Genexpression Veränderungen auf molekularer Ebene zu untersuchen vorsehen. In unserer Erfahrung ist der wichtigste Schritt für eine erfolgreiche Faser Trennung der "Sehne Sehne" Isolation (Schritte von 2,5 bis 2,9 im Protokoll Text). Dies gewährleistet, dass nach Muskel Verdauung, Fasern aus der EDL mit minimalen oder keinen Schaden wodurch ihre Leistung in folgenden Schritten freigegeben.
The authors have nothing to disclose.
Wir möchten Sarah Dick für die Bereitstellung von kritischen Lektüre und Kommentare. MAR hält den Canada Research Chair in Molecular Genetics und ist ein International Research Scholar des Howard Hughes Medical Institute. Diese Arbeit wurde durch Stipendien an MAR von den National Institutes of Health, der Howard Hughes Medical Institute, die kanadische Institutes of Health Research, die Muskeldystrophie Association und der Canada Research Chair Program unterstützt.
Reagent/Material | |||
Collagenase | Sigma-Aldrich | C0130-1g | Prepare fresh all times for optimal results. Additional aliquots of undiluted collagenase can be stored at -20 °C. |
DMEM High Glucose + NaPyr | Invitrogen | 11995073 | Addition of Pen/Strep is necessary to minimize air contaminations |
Characterized Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30396.03 | Lot #KUJ35152 |
Horse Serum | Hyclone | SH300.74.03 | Lot #AVJ82494 |
Chicken Embryo Extract | Accurate Chemical | CE-650-T, Batch B7035010 | Avoid freezing-thawing cycles. |
Matrigel | BD | Store aliquots at -20 °C. Avoid freezing-thawing cycles. Store diluted aliquots at 4 °C. | |
Equipment | |||
Cohann-Vannas Spring Scissor 6mm Blades-Straight-Sharp | Fine Science Tools | 15000-02 | |
Extra Thin Iris Scissors- 10.5cm | Fine Science Tools | 14088-10 | |
Moria-Iris Forceps Curved | Fine Science Tools | 11373-12 | |
Pasteur Pipettes | VWR | 14672-380 | 14672-200 |
Diamond Pen | VWR | 52865-005 | |
60*15mm Petri Dish | VWR | 25384-092 | |
Acrodisc 0.22 μm Filter | VWR | CA28-145-477 | |
Dissecting Microscope StemiV6 | Zeiss | An additional light source may be required to have a better focus view |