Una lectura molecular de adaptación a largo plazo olfativa en<em> C. elegans</em
Summary
Aquí describimos una lectura molecular de adaptación a largo plazo olfativo en<em> Caenorhabditis elegans</em>. La proteína quinasa G, EGL-4, es necesario para las respuestas de adaptación estables en el par de neurona sensorial primaria llamada AWC. Durante la exposición prolongados olor EGL-4 transloca del citosol al núcleo de la AWC.
Abstract
Durante la estimulación sostenida neuronas sensoriales más adaptarán su respuesta al disminuir su sensibilidad a la señal. La respuesta de adaptación ayuda a la atención de forma y también protege las células de la sobre-estimulación. La adaptación en el circuito olfatorio de C. elegans fue descrita por primera vez por Colbert y Bargmann 1,2. Aquí, los autores definieron los parámetros del paradigma de la adaptación olfativa, que se utiliza para diseñar una pantalla genética para aislar mutantes defectuosos en su capacidad para adaptarse a los olores volátiles detectados por las células amphid Ala tipo C (AWC) neuronas sensoriales. Cuando wildtype C. elegans animales se exponen a un atractivo AWC-detectados olor 3 de 30 min se adaptarán su capacidad de respuesta al olor y entonces ignorar el olor en la adaptación de un ensayo de quimiotaxis de comportamiento para ~ 1 hr. Cuando wildtype C. elegans animales se exponen a un atractivo AWC-detectados olor de ~ 1 hr luego de ignorar el olor en la adaptación de achemotaxis comportamiento ensayo para ~ 3 h. Estas dos fases de adaptación olfativa en C. elegans fueron descritos como de corto plazo adaptación olfativa (inducido después de 30 min de exposición olor), y adaptación a largo plazo olfativo (inducido después de 60 min de exposición olor). Un trabajo posterior de L'Etoile et al., 4 descubierto una proteína kinasa G (PKG) llamado EGL-4 que se requiere tanto para la adaptación olfativa a corto plazo ya largo plazo en las neuronas de AWC. El EGL-4 proteína contiene una secuencia de localización nuclear que es necesaria para la respuesta a largo plazo de adaptación olfativas pero prescindible para respuestas a corto plazo de adaptación olfativas en el AWC 4. Mediante el etiquetado de EGL-4 con una proteína fluorescente verde, que era posible visualizar la localización de EGL-4 en la AWC durante la exposición prolongada olor. El uso de este completamente funcional GFP-etiquetados EGL-4 (GFP :: EGL-4) molécula hemos sido capaces de desarrollar una lectura molecular de adaptación a largo plazo olfativo en la AWC 5. El uso de este molecular lectura de la adaptación olfativa hemos sido capaces de realizar ambas pantallas genéticas de avance y retroceso para identificar animales mutantes que exhiben defectuosos patrones de localización subcelular de GFP :: EGL-4 en la AWC 6,7. Aquí se describe: 1) la construcción de GFP :: EGL-4 animales que expresan; 2) el protocolo para el cultivo de los animales para los ensayos a largo plazo inducida por la translocación olor nucleares, y 3) la puntuación de la largo plazo olor inducida evento translocación nuclear y la recuperación (re-sensibilización) de la GFP nuclear :: EGL-4 Estado.
Protocol
Representative Results
Discussion
La entrada nuclear inducida por el olor de un GFP-etiquetados EGL-4 molécula descrito aquí proporciona una lectura sólida molecular de la adaptación olfativa en C. elegans. Los ensayos nucleares inducidas olor-translocación son sencillas y requieren sólo unos pocos días de tiempo de preparación. El animal pyIs500 que hemos construido para estos ensayos, expresa un marcador que ilumina la neurona AWC, así como la expresión de la GFP-etiquetados EGL-4 proteínas. Por lo tanto, creemos que un ex…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría dar las gracias a Scott Hamilton, y los miembros del laboratorio O'Halloran para la lectura de este manuscrito. También agradecemos a nuestro revisor anónimo por excelentes sugerencias y comentarios perspicaces.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Bacto Agar | Difco | DF0140-07-4 | NGM plates |
| Sodium Chloride | Fisher Chemical | S671-10 | NGM plates |
| Bacto Peptone | Difco | DF0118-07-2 | NGM plates |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Chemical | S375-500 | S-Basal buffer and NGM plates |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Chemical | P285-500 | S-Basal buffer and NGM plates |
| Kimwipes – Small | Kimberly-Clark | LS2770 | |
| Ethanol 100% | Gold Shield Chemical Co. | 43196-115 | diluting odors for chemotaxis assays |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C8106-500G | NGM plates |
| Magnesium Sulphate | MP Biomedicals | 150136-500G | NGM plates |
| Sodium Azide 99% | Fisher Scientific | ICN10289180 | Anesthetic |
| Agarose – UltraPure | Invitrogen | 16500-500 | Agarose pads |
| Benzaldehyde | Sigma-Aldrich | B1334-100G | AWC odor |
| Butanone, ACS Grade | Sigma-Aldrich | 360473-500ML | AWC odor |
| Microcentrifuge Tubes – 1.5 ml Colored | Denville | LS8147 | |
| Pasteur Pipet Disposable Glass 5-3/4″ | Fisher Scientific | 13-678-20B | |
| Stratalinker | Stratagene | Stratalinker 2400 | UV integration |
| Filter Vacuum Bottle – 500 ml | Nalgene | 09-740-25B |
Referencias
- Colbert, H. A., Bargmann, C. I. Odorant-specific adaptation pathways generate olfactory plasticity in C. elegans. Neuron. 14 (4), 803 (1995).
- Colbert, H. A., Bargmann, C. I. Environmental signals modulate olfactory acuity, discrimination, and memory in Caenorhabditis elegans. Learning and Memory. 4 (2), 179 (1997).
- Bargmann, C. I., et al. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Neuron. 74 (3), 515 (1993).
- L’Etoile, N. D., et al. The cyclic GMP-dependent protein kinase EGL-4 regulates olfactory adaptation in C. elegans. Neuron. 36, 1079-10 (2002).
- Lee, J. I., et al. Nuclear entry of a cGMP-dependent kinase converts transient into long-lasting olfactory adaptation. PNAS. 107 (13), 6016 (2010).
- O’Halloran, D. M., et al. Regulators of AWC-mediated olfactory plasticity in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 5 (12), e1000761 (2009).
- O’Halloran, D. M., et al. Changes in cGMP levels affect the localization of EGL-4 in AWC in Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. 7 (2), e31614 (2012).
- Mello, C. C., et al. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO Journal. 10, 3959-39 (1991).
- Miyabayashi, T., et al. Expression and function of members of a divergent nuclear receptor family in Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 215, 314 (1999).
- L’Etoile, N. D., Bargmann, C. I. Olfaction and odor discrimination are mediated by the C. elegans guanylyl cyclase ODR-1. Neuron. 25 (3), 575 (2000).
- Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods Cell Biol. 48, 451 (1995).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. Wormbook. , (2006).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genética. 77 (1), 71 (1974).
- Kauffman, A., Parsons, L., Stein, G., Wills, A., Kaletsky, R., Murphy, C. C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays. J. Vis. Exp. (49), e2490 (2011).
- Berkowitz, L. A., Hamamichi, S., Knight, A. L., Harrington, A. J., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson’s Disease Genes. J. Vis. Exp. (17), e835 (2008).
- Pittenger, C., Kandel, E. R. In search of general mechanisms for long-lasting plasticity: Aplysia and the hippocampus. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 358 (1432), 757 (2003).
