Молекулярная Считывание Долгосрочные обонятельной адаптации в<em> C. Элеганс</em
Summary
Здесь мы опишем молекулярного считывания долгосрочных обонятельной адаптации в<em> Caenorhabditis Элеганс</em>. Протеинкиназы G, EGL-4, необходимо для стабильного адаптационных мер в первичных сенсорных нейронов называется пара AWC. При длительном воздействии запаха EGL-4 транслоцируется из цитозоля в ядро AWC.
Abstract
Во время стимуляции наиболее устойчивых сенсорных нейронов будет адаптировать свой ответ к снижению их чувствительности к сигналу. Адаптацией ответ помогает форма внимание, а также защищает клетки от чрезмерной стимуляции. Адаптация в обонятельной схемы C. Элеганс был впервые описан Кольбер и Баргмана 1,2. Здесь авторы заданных параметров обонятельной парадигмы адаптации, который они использовали для разработки генетических экрана, чтобы изолировать мутантов дефектные в их способности адаптироваться к летучие запахи воспринимаются амфидов крыла клетки типа С (AWC) сенсорных нейронов. Когда дикого типа C. Элеганс животные подвергаются воздействию привлекательной AWC-почувствовали запах 3 в течение 30 минут они будут адаптировать свои реакции на запах и будет игнорировать адаптации запах в хемотаксиса поведенческого анализа для ~ 1 час. Когда дикого типа C. Элеганс животные подвергаются воздействию привлекательной AWC-почувствовали запах в течение ~ 1 час затем они будут игнорировать адаптации запах в переменного токаhemotaxis поведенческого анализа для ~ 3 часа. Эти две фазы обонятельной адаптации в C. Элеганс были описаны как краткосрочные обонятельной адаптации (индуцированные после 30 мин воздействия запаха), и долгосрочные обонятельной адаптации (индуцированные после 60 мин воздействия запаха). Позже работать с L'Etoile и соавт., 4 раскрыли протеинкиназы G (PKG) называется EGL-4, что необходимо как для краткосрочного и долгосрочного обонятельной адаптации в AWC нейронов. EGL-4 белок содержит последовательность ядерной локализации, что необходимо для долгосрочного обонятельные ответы адаптации, но необязательны для краткосрочных обонятельные адаптационных мер в AWC 4. По теги EGL-4 с зеленого флуоресцентного белка, можно было визуализировать локализацию EGL-4 в AWC при длительном воздействии запаха. С помощью этого полнофункционального GFP с метками EGL-4 (GFP :: EGL-4) молекулы мы смогли разработать молекулярные считывания долгосрочных обонятельной адаптации в AWC 5. Используя эту мolecular считывания обонятельной адаптации мы были в состоянии выполнять как прямой и обратный генетический экраны для идентификации мутантных животных, которые проявляют дефектных моделей субклеточном локализации GFP :: EGL-4 в AWC 6,7. Здесь мы опишем: 1) строительство GFP :: EGL-4 выразив животных; 2) протокол для выращивания животных для долгосрочного запаха вызванного ядерной транслокации анализов и 3) на счет в долгосрочной запаха вызванного ядерном событии перемещения и восстановления (повторной сенсибилизации) от ядерных GFP :: EGL-4 состояние.
Protocol
Representative Results
Discussion
Запах вызванной ядерным вступления GFP с метками EGL-4 молекулы описано здесь обеспечивает надежную молекулярного считывания обонятельной адаптации в C. Элеганс. Запах вызванной ядерным анализы транслокации просты и требуют лишь несколько дней на подготовку. PyIs500 животное, кото…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Скотта Хэмилтона, и члены лаборатории O'Halloran за внимательное чтение этой рукописи. Мы также благодарим нашего анонимного рецензента за отличные предложения и проницательными комментариями.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Bacto Agar | Difco | DF0140-07-4 | NGM plates |
| Sodium Chloride | Fisher Chemical | S671-10 | NGM plates |
| Bacto Peptone | Difco | DF0118-07-2 | NGM plates |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Chemical | S375-500 | S-Basal buffer and NGM plates |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Chemical | P285-500 | S-Basal buffer and NGM plates |
| Kimwipes – Small | Kimberly-Clark | LS2770 | |
| Ethanol 100% | Gold Shield Chemical Co. | 43196-115 | diluting odors for chemotaxis assays |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C8106-500G | NGM plates |
| Magnesium Sulphate | MP Biomedicals | 150136-500G | NGM plates |
| Sodium Azide 99% | Fisher Scientific | ICN10289180 | Anesthetic |
| Agarose – UltraPure | Invitrogen | 16500-500 | Agarose pads |
| Benzaldehyde | Sigma-Aldrich | B1334-100G | AWC odor |
| Butanone, ACS Grade | Sigma-Aldrich | 360473-500ML | AWC odor |
| Microcentrifuge Tubes – 1.5 ml Colored | Denville | LS8147 | |
| Pasteur Pipet Disposable Glass 5-3/4″ | Fisher Scientific | 13-678-20B | |
| Stratalinker | Stratagene | Stratalinker 2400 | UV integration |
| Filter Vacuum Bottle – 500 ml | Nalgene | 09-740-25B |
Referencias
- Colbert, H. A., Bargmann, C. I. Odorant-specific adaptation pathways generate olfactory plasticity in C. elegans. Neuron. 14 (4), 803 (1995).
- Colbert, H. A., Bargmann, C. I. Environmental signals modulate olfactory acuity, discrimination, and memory in Caenorhabditis elegans. Learning and Memory. 4 (2), 179 (1997).
- Bargmann, C. I., et al. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Neuron. 74 (3), 515 (1993).
- L’Etoile, N. D., et al. The cyclic GMP-dependent protein kinase EGL-4 regulates olfactory adaptation in C. elegans. Neuron. 36, 1079-10 (2002).
- Lee, J. I., et al. Nuclear entry of a cGMP-dependent kinase converts transient into long-lasting olfactory adaptation. PNAS. 107 (13), 6016 (2010).
- O’Halloran, D. M., et al. Regulators of AWC-mediated olfactory plasticity in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 5 (12), e1000761 (2009).
- O’Halloran, D. M., et al. Changes in cGMP levels affect the localization of EGL-4 in AWC in Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. 7 (2), e31614 (2012).
- Mello, C. C., et al. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO Journal. 10, 3959-39 (1991).
- Miyabayashi, T., et al. Expression and function of members of a divergent nuclear receptor family in Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 215, 314 (1999).
- L’Etoile, N. D., Bargmann, C. I. Olfaction and odor discrimination are mediated by the C. elegans guanylyl cyclase ODR-1. Neuron. 25 (3), 575 (2000).
- Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods Cell Biol. 48, 451 (1995).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. Wormbook. , (2006).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genética. 77 (1), 71 (1974).
- Kauffman, A., Parsons, L., Stein, G., Wills, A., Kaletsky, R., Murphy, C. C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays. J. Vis. Exp. (49), e2490 (2011).
- Berkowitz, L. A., Hamamichi, S., Knight, A. L., Harrington, A. J., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson’s Disease Genes. J. Vis. Exp. (17), e835 (2008).
- Pittenger, C., Kandel, E. R. In search of general mechanisms for long-lasting plasticity: Aplysia and the hippocampus. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 358 (1432), 757 (2003).
