Peptid: MHC-Tetramer-basierte Anreicherung von Epitop-spezifischer T-Zellen
Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Peptid: MHC-Tetrameren und magnetische Mikrobeads zur niederfrequenten Populationen von Epitop-spezifischen T-Zellen zu isolieren und zu analysieren durch Durchflusszytometrie. Dieses Verfahren ermöglicht die direkte Untersuchung von endogenen T-Zell-Populationen von Interesse<em> In vivo</em> Experimentellen Systemen.
Abstract
Eine Grundvoraussetzung für die Forscher studieren adaptiven Immunität in vivo experimentellen Modellen ist die Fähigkeit, T-Zellen auf ihren T-Zell-Antigenrezeptor (TCR)-Spezifität zu identifizieren. Viele indirekte Methoden zur Verfügung, in denen ein Schüttgut Population von T-Zellen in vitro mit einem Antigen und Epitop-spezifischer T-Zellen werden durch die Messung einer funktionalen Antwort wie Proliferation, Zytokinproduktion, oder Expression der Aktivierungsmarker 1 identifiziert wird angeregt. Jedoch sind diese Methoden nur identifizieren Epitop-spezifischen T-Zellen, die eine von vielen möglichen Funktionen, und sie sind nicht empfindlich genug, um Epitop-spezifischer T-Zellen bei naiven Vorstufe Frequenzen zu detektieren. Eine beliebte Alternative ist die TCR-transgene adoptiven Transfer Modell, in dem monoklonalen T-Zellen aus einem transgenen Maus TCR in histokompatiblen Hosts ausgesät, um eine große Population von Vorläufer-Epitop-spezifische T-Zellen, die easi sein könnenly mit der Verwendung eines kongenen Markerantikörper 2,3 nachverfolgt. Wenn leistungsfähig leidet dieses Verfahren aus experimentellen Artefakte mit der unphysiologischen Häufigkeit von T-Zellen mit einer Spezifität für ein einzelnes Epitop 4,5 zugeordnet. Darüber hinaus kann dieses System nicht verwendet, um die funktionelle Heterogenität der Epitop-spezifische T-Zell-Klone in einer polyklonalen Population untersuchen.
Der ideale Weg zur adaptiven Immunität studieren sollte den direkten Nachweis Epitop-spezifischer T-Zellen aus dem endogenen T-Zell-Repertoire mit einer Methode, TCR Aspekt unterscheidet ausschließlich durch dessen Bindung an cognate Peptid: MHC (pMHC)-Komplexe. Die Verwendung von Tetrameren pMHC und Durchflusszytometrie erreicht dieses 6, jedoch wird auf die Erfassung von hochfrequenten Populationen von Epitop-spezifischer T-Zellen nur gefunden folgenden antigeninduzierte klonale Expansion begrenzt. In diesem Protokoll beschreiben wir eine Methode, die die Verwendung von pMHC Tetramere koordiniert und magnetic Zellanreicherung Technologie, um Erkennung von extrem niederfrequenten Epitop-spezifischer T-Zellen aus der Maus Lymphgewebe 3,7. Mit dieser Technik kann ein umfassender verfolgen gesamte epitopspezifischen Populationen von endogenen T-Zellen in Mäusen in allen Stadien der Immunantwort.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die pMHC Tetramer basierte Anreicherung von Zellen-Methode von diesem Protokoll vorgestellt ist ein leistungsfähiges Werkzeug für das Studium Epitop-spezifischer T-Zellen aus körpereigenen T-Zellen Repertoires. Die Verwendung von Tetrameren pMHC ermöglicht Nachweis Epitop-spezifischer T-Zellen direkt auf die Fähigkeit ihrer TCRs auf artverwandten pMHC Liganden binden. Die Anreicherung stellt einen Grad der Empfindlichkeit derart, dass extrem selten Populationen von Antigen-spezifischen T-Zellen aus endogenen Repert…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren bedanken sich bei Andre Han und Lawrence Yen für die technische Unterstützung, und die Mitglieder der Jenkins Labor für Hilfe bei der Entwicklung dieses Protokolls danken.
Materials
| Reagent | Vendor | Catalog number |
| PE or APC conjugated pMHC tetramer (or multimer) | Made by investigator, obtained from the NIH tetramer core, or purchased from commercial sources | |
| Anti-PE conjugated magnetic microbeads | Miltenyi | 130-048-801 |
| Anti-APC conjugated magnetic microbeads | Miltenyi | 130-090-855 |
| LS magnetic columns | Miltenyi | 130-042-401 |
| MidiMACS or QuadroMACS magnet | Miltenyi | 130-042-302 or 130-090-976 |
| Cell counting beads | Life Technologies | PCB-100 |
Referencias
- Knutson, K. L., dela Rosa, C., Disis, M. L. Laboratory analysis of T-cell immunity. Front Biosci. 11, 1932-1944 (2006).
- Kearney, E. R., Pape, K. A., Loh, D. Y., Jenkins, M. K. Visualization of peptide-specific T cell immunity and peripheral tolerance induction in vivo. Immunity. 1, 327-339 (1994).
- Moon, J. J. Tracking epitope-specific T cells. Nat Protoc. 4, 565-581 (2009).
- Hataye, J., Moon, J. J., Khoruts, A., Reilly, C., Jenkins, M. K. Naive and memory CD4+ T cell survival controlled by clonal abundance. Science. 312, 114-116 (2006).
- Marzo, A. L. Initial T cell frequency dictates memory CD8+ T cell lineage commitment. Nat Immunol. 6, 793-799 (2005).
- Davis, M. M., Altman, J. D., Newell, E. W. Interrogating the repertoire: broadening the scope of peptide-MHC multimer analysis. Nature reviews. Immunology. 11, 551-558 (2011).
- Moon, J. J. Naive CD4(+) T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude. Immunity. 27, 203-213 (2007).
- Seah, S. G. The linear range for accurately quantifying antigen-specific T-cell frequencies by tetramer staining during natural immune responses. European Journal of Immunology. 41, 1499-1500 (2011).
- Obar, J. J., Khanna, K. M., Lefrancois, L. Endogenous naive CD8+ T cell precursor frequency regulates primary and memory responses to infection. Immunity. 28, 859-869 (2008).
- Daniels, M. A., Jameson, S. C. Critical role for CD8 in T cell receptor binding and activation by peptide/major histocompatibility complex multimers. J Exp Med. 191, 335-346 (2000).
- Pittet, M. J. Alpha 3 domain mutants of peptide/MHC class I multimers allow the selective isolation of high avidity tumor-reactive CD8 T cells. Journal of Immunology. 171, 1844-1849 (2003).
- Choi, E. M. High avidity antigen-specific CTL identified by CD8-independent tetramer staining. Journal of Immunology. 171, 5116-5123 (2003).
- Chu, H. H. Positive selection optimizes the number and function of MHCII-restricted CD4+ T cell clones in the naive polyclonal repertoire. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 11241-11245 (2009).
- Chu, H. H., Moon, J. J., Kruse, A. C., Pepper, M., Jenkins, M. K. Negative Selection and Peptide Chemistry Determine the Size of Naive Foreign Peptide-MHC Class II-Specific CD4+ T Cell Populations. J Immunol. 185, 4705-4713 (2010).
- Legoux, F. Impact of TCR reactivity and HLA phenotype on naive CD8 T cell frequency in humans. J Immunol. 184, 6731-6738 (2010).
- Alanio, C., Lemaitre, F., Law, H. K., Hasan, M., Albert, M. L. Enumeration of human antigen-specific naive CD8+ T cells reveals conserved precursor frequencies. Blood. 115, 3718-3725 (2010).
- Kwok, W. W. Frequency of Epitope-Specific Naive CD4+ T Cells Correlates with Immunodominance in the Human Memory Repertoire. Journal of Immunology. 188, 2537-2544 (2012).
- Jenkins, M. K., Chu, H. H., McLachlan, J. B., Moon, J. J. On the composition of the preimmune repertoire of T cells specific for Peptide-major histocompatibility complex ligands. Annu Rev Immunol. 28, 275-294 (2010).
- Matechak, E. O., Killeen, N., Hedrick, S. M., Fowlkes, B. J. MHC class II-specific T cells can develop in the CD8 lineage when CD4 is absent. Immunity. 4, 337-347 (1996).
- Burchill, M. A. Linked T cell receptor and cytokine signaling govern the development of the regulatory T cell repertoire. Immunity. 28, 112-121 (2008).
- Pepper, M. Different routes of bacterial infection induce long-lived TH1 memory cells and short-lived TH17 cells. Nature Immunology. 11, 83-89 (2010).
