Пептиды: MHC тетрамеров на основе обогащения эпитопов Т-клеток
Summary
Этот протокол описывает использование пептидов: MHC тетрамеров и магнитных микросфер, чтобы изолировать низкой популяции частота эпитопов Т-клеток и их анализ с помощью проточной цитометрии. Этот метод позволяет непосредственное изучение эндогенных T клеточных популяций интерес со стороны<em> В естественных условиях</em> Экспериментальных систем.
Abstract
Первой необходимости для исследователей, изучающих адаптивного иммунитета в естественных условиях экспериментальной модели является способность идентифицировать Т-клеток в зависимости от их рецепторов Т-клеточного антигена (TCR) специфичность. Многие косвенные методы доступны, в которых большая часть популяции Т-клеток стимулируется в пробирке со специфическим антигеном и эпитоп-специфических Т-клеток, определяются с помощью измерения функционального ответа, таких как пролиферация, продукции цитокинов, или экспрессия маркеров активации 1. Однако, эти методы только определить эпитоп-специфических Т-клеток с одним из многих возможных функций, и они не достаточно чувствительны, чтобы обнаружить эпитоп-специфических Т-клеток на наивных частоты предшественника. Популярной альтернативой является TCR трансгенных приемных модель передачи, в которых моноклональных Т-клеток от мышей TCR трансгенных высевают в гистосовместимого хостов для создания большого населения предшественник эпитоп-специфических Т-клеток, которые могут быть EASIют отслеживается с использованием антител конгенных маркер 2,3. В то время как мощные, этот метод страдает от экспериментальных артефактов, связанных с нефизиологические частота Т-клеток со спецификой для одного эпитопа 4,5. Кроме того, эта система не может быть использован для исследования функциональной гетерогенности эпитоп-специфических Т-клеточных клонов в поликлональных населения.
Идеальный способ для изучения адаптивного иммунитета должны предусматривать прямое обнаружение эпитоп-специфических Т-клеток от эндогенных репертуара Т-клеток, используя метод, который отличает специфичность TCR исключительно его связывание с родственными пептид: MHC (ПКИКЖ) комплексов. Использование ПКИКЖ тетрамеров и проточной цитометрии решает эту задачу 6, но ограничен обнаружения высокой частотой населения эпитоп-специфических Т-клеток можно найти только следующие антиген-индуцированной клональной экспансии. В этом протоколе, мы опишем метод, который координирует использование тетрамеров ПКИКЖ и Магнетик клетке технологии обогащения позволяют обнаружить крайне низкой частоты эпитоп-специфических Т-клеток от мышей лимфоидной ткани 3,7. С помощью этого метода, можно всесторонне отслеживать весь эпитопа конкретных популяций эндогенных Т-клеток у мышей на всех этапах иммунного ответа.
Protocol
Representative Results
Discussion
ПКИКЖ тетрамера на основе метода обогащения клетки представленные этого протокола является мощным инструментом для изучения эпитоп-специфических Т-клеток от эндогенных T репертуар клетки. Использование тетрамеров ПКИКЖ позволяет обнаруживать эпитоп-специфических Т-клеток основан ?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Андре Хан и Лоуренс иен для оказания технической помощи, а также члены Дженкинс лаборатории за помощь в развитии этого протокола.
Materials
| Reagent | Vendor | Catalog number |
| PE or APC conjugated pMHC tetramer (or multimer) | Made by investigator, obtained from the NIH tetramer core, or purchased from commercial sources | |
| Anti-PE conjugated magnetic microbeads | Miltenyi | 130-048-801 |
| Anti-APC conjugated magnetic microbeads | Miltenyi | 130-090-855 |
| LS magnetic columns | Miltenyi | 130-042-401 |
| MidiMACS or QuadroMACS magnet | Miltenyi | 130-042-302 or 130-090-976 |
| Cell counting beads | Life Technologies | PCB-100 |
Referencias
- Knutson, K. L., dela Rosa, C., Disis, M. L. Laboratory analysis of T-cell immunity. Front Biosci. 11, 1932-1944 (2006).
- Kearney, E. R., Pape, K. A., Loh, D. Y., Jenkins, M. K. Visualization of peptide-specific T cell immunity and peripheral tolerance induction in vivo. Immunity. 1, 327-339 (1994).
- Moon, J. J. Tracking epitope-specific T cells. Nat Protoc. 4, 565-581 (2009).
- Hataye, J., Moon, J. J., Khoruts, A., Reilly, C., Jenkins, M. K. Naive and memory CD4+ T cell survival controlled by clonal abundance. Science. 312, 114-116 (2006).
- Marzo, A. L. Initial T cell frequency dictates memory CD8+ T cell lineage commitment. Nat Immunol. 6, 793-799 (2005).
- Davis, M. M., Altman, J. D., Newell, E. W. Interrogating the repertoire: broadening the scope of peptide-MHC multimer analysis. Nature reviews. Immunology. 11, 551-558 (2011).
- Moon, J. J. Naive CD4(+) T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude. Immunity. 27, 203-213 (2007).
- Seah, S. G. The linear range for accurately quantifying antigen-specific T-cell frequencies by tetramer staining during natural immune responses. European Journal of Immunology. 41, 1499-1500 (2011).
- Obar, J. J., Khanna, K. M., Lefrancois, L. Endogenous naive CD8+ T cell precursor frequency regulates primary and memory responses to infection. Immunity. 28, 859-869 (2008).
- Daniels, M. A., Jameson, S. C. Critical role for CD8 in T cell receptor binding and activation by peptide/major histocompatibility complex multimers. J Exp Med. 191, 335-346 (2000).
- Pittet, M. J. Alpha 3 domain mutants of peptide/MHC class I multimers allow the selective isolation of high avidity tumor-reactive CD8 T cells. Journal of Immunology. 171, 1844-1849 (2003).
- Choi, E. M. High avidity antigen-specific CTL identified by CD8-independent tetramer staining. Journal of Immunology. 171, 5116-5123 (2003).
- Chu, H. H. Positive selection optimizes the number and function of MHCII-restricted CD4+ T cell clones in the naive polyclonal repertoire. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 11241-11245 (2009).
- Chu, H. H., Moon, J. J., Kruse, A. C., Pepper, M., Jenkins, M. K. Negative Selection and Peptide Chemistry Determine the Size of Naive Foreign Peptide-MHC Class II-Specific CD4+ T Cell Populations. J Immunol. 185, 4705-4713 (2010).
- Legoux, F. Impact of TCR reactivity and HLA phenotype on naive CD8 T cell frequency in humans. J Immunol. 184, 6731-6738 (2010).
- Alanio, C., Lemaitre, F., Law, H. K., Hasan, M., Albert, M. L. Enumeration of human antigen-specific naive CD8+ T cells reveals conserved precursor frequencies. Blood. 115, 3718-3725 (2010).
- Kwok, W. W. Frequency of Epitope-Specific Naive CD4+ T Cells Correlates with Immunodominance in the Human Memory Repertoire. Journal of Immunology. 188, 2537-2544 (2012).
- Jenkins, M. K., Chu, H. H., McLachlan, J. B., Moon, J. J. On the composition of the preimmune repertoire of T cells specific for Peptide-major histocompatibility complex ligands. Annu Rev Immunol. 28, 275-294 (2010).
- Matechak, E. O., Killeen, N., Hedrick, S. M., Fowlkes, B. J. MHC class II-specific T cells can develop in the CD8 lineage when CD4 is absent. Immunity. 4, 337-347 (1996).
- Burchill, M. A. Linked T cell receptor and cytokine signaling govern the development of the regulatory T cell repertoire. Immunity. 28, 112-121 (2008).
- Pepper, M. Different routes of bacterial infection induce long-lived TH1 memory cells and short-lived TH17 cells. Nature Immunology. 11, 83-89 (2010).
