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Bioingeniería

In sintesi in vitro di Native, Spaziatura fibrosa lungo e segmentale collagene spaziatura lungo

Published: September 20, 2012
doi:
10.3791/4417
, , , ,
1Department of Chemistry,University of Toronto, 2Institute for Optical Sciences,University of Toronto

Summary

Procedure semplici e riproducibili sono descritte per la realizzazione di tre assemblee collagene strutturalmente distinti da un tipo comune, disponibile in commercio ho monomero collagene. Tipo nativo, fibroso spaziatura lungo o segmentale collagene spaziatura lungo può essere costruito variando le condizioni a cui i 300 nm di lunghezza e diametro di 1.4 nm blocco monomero edificio è esposto.

Abstract

Fibrille di collagene sono presenti nella matrice extracellulare del tessuto animale per fornire ponteggio strutturale e resistenza meccanica. Queste fibrille di collagene nativo ha una periodicità caratteristica bande di ~ 67 nm e sono formati in vivo attraverso l'assemblaggio gerarchico di tipo I monomeri collagene, che sono 300 nm di lunghezza e 1,4 nm di diametro. In vitro, variando le condizioni alle quali l' blocchi monomero sono esposti, strutture uniche che vanno in scale di lunghezza fino a 50 micron possono essere costruiti, tra cui non solo fibrille di tipo nativo, ma anche fibrosa spaziatura lungo e segmentale collagene spaziatura lungo. Qui, presentiamo procedimenti di formazione delle tre strutture collagene diversi da un monomero comune collagene disponibile in commercio. Utilizzando i protocolli che noi e altri hanno pubblicato in passato per rendere questi tre tipi di solito portano a miscele di strutture. In particolare, fibrille unbanded erano comunemente found quando si effettua collagene nativo, e fibrille native erano spesso presenti quando si effettua fibroso collagene lunga distanza. Queste nuove procedure hanno il vantaggio di produrre il desiderato tipo quasi esclusivamente fibrille di collagene. La formazione delle strutture desiderate è verificata immagini utilizzando un microscopio a forza atomica.

Introduction

Il collagene è una classe di proteine ​​strutturali che hanno una struttura a tripla elica formata da tre catene polipeptidiche. Questi monomeri tripla elica inoltre riunirsi in modo gerarchico a formare strutture sempre più grandi. Ci sono almeno 28 tipi di collagene geneticamente diversi che sono stati identificati 1. Insieme, collagene costituiscono il 30% delle proteine ​​totali trovato in animali, di tipo I con la contabilità forma predominante fino al 90% di tutte le proteine ​​del collagene 2. Collagene di tipo I si trova come strutture fibrillous in pelle, legamenti, tendini e ossa. Microscopio a forza atomica (AFM) e microscopio elettronico (EM) immagini di tipo I fibre di collagene nativo di solito mostrano bande con un periodo caratteristico di ~ 67 nm (spesso definito come D-banding) 3-5.

Monomero di tipo I collagene è una eterotrimero tripla elica composta da due identici α1 (I) catene e un α2 (I) catena, ciascuno più di unmille amminoacidi lunghi. È lungo e sottile con dimensioni di 300 nm di lunghezza e 1,4 nm di diametro. Monomero collagene di tipo I può essere facilmente ottenuta con rompersi formatesi naturalmente strutture di ordine superiore 6. Abbiamo 7 e molti altri 8-10 hanno mostrato che questi solubili blocchi monomero può quindi essere utilizzato per ricostruire D-banda fibrille in vitro (Figura 1).

Oltre a fibrille di collagene nativo, due altre strutture collagene di ordine superiore sono stati trovati per formare in vitro utilizzando lo stesso blocco di monomero. Le due strutture sono fibrose spaziatura lungo (FLS) e segmentale spaziatura lungo (SLS) collagene (Figura 1). FLS collagene è un costrutto fibrillous come collagene nativo, ma è caratterizzata da una periodicità più bande di collagene nativo 11. In vitro, collagene FLS forma quando il monomero collagene è combinato con α1-glicoproteina acida <sup> 12. Collagene FLS è stata osservata in vivo e, anche se raramente 13. Collagene SLS è descritto come cristalliti perché i monomeri sono allineati nel registro come in un reticolo cristallino 14. Collagene SLS forma quando il monomero collagene è combinato con l'adenosina trifosfato (ATP) 15. Naturale collagene SLS è stato osservato nel mezzo di coltura di fibroblasti ma non in campioni di tessuto estratti, probabilmente a causa della sua piccola dimensione e la mancanza di distinguibili caratteristiche topografiche 16.

L'obiettivo di questo manoscritto è quello di presentare le procedure dettagliate per la preparazione di fibrille di collagene nativo come pure FLS e collagene SLS che anche il ricercatore più inesperto in grado di riprodurre. L'utilizzo di materiali avanzati disponibili in commercio a partire, abbiamo cercato di rendere i protocolli più semplice possibile e ancora li hanno funzionare correttamente. Abbiamo anche dettagliatamente come utilizzare un AFM per caratterizzare la diversa struttura del collagenes che sono fatti. Questo lavoro sarà utile per i ricercatori che vogliono studiare una o più di queste strutture di ordine superiore di collagene e / o utilizzare come precursori in altre applicazioni, ma attualmente la mancanza di competenze o semplicemente non vogliono lavorare con campioni di tessuto.

Protocol

NOTA: L'acqua utilizzata in tutti i protocolli ha una resistività> 18 MΩ.cm. 1. Fibrille di collagene nativo Combinare 6 microlitri di acqua, 20 pl di 200 mM Na 2 HPO 4 regolato a pH 7 con HCl e 10 pl di 400 mM KCl in una provetta e mescolare. Aggiungere 4 ml di collagene monomero (~ 3 mg / ml in 0,01 N HCl) nella provetta per microcentrifuga e mescolare. La soluzione deve essere limpida e incolore. Posizionare la provetta da microcentrifuga contenente la miscela di reazione in un blocco di calore che è stato pre-riscaldato a 37 ° C e lasciato per 3 a 4 ore. A questo punto, la soluzione deve essere leggermente nuvoloso e contiene fibrille di collagene prevalentemente nativi. 2. Fibrosa collagene spaziatura lungo Dializza 1 ml di collagene monomero (~ 3 mg / ml in 0,01 N HCl) utilizzando 12-14 kDa membrana MWCO contro 400 ml di acqua, cambiando l'acqua quattro volte per un periodo di 24 ore a temperatura ambiente. Il collag dializzatoen monomero che non viene utilizzato subito può essere conservato a 4 ° C per un uso futuro. Combinare 20 pl di acqua, 20 ml di 3 mg / ml α1-glicoproteina acida in acqua e 20 ml di collagene monomero dializzato in una provetta per microcentrifuga. La soluzione deve essere limpida e incolore. Lasciare la provetta da microcentrifuga contenente la miscela di reazione a temperatura ambiente per 30 min. A questo punto, la soluzione deve essere nuvoloso e contenere fibrille di collagene prevalentemente FLS. 3. Segmentale collagene spaziatura lungo Combinare 67 microlitri di acqua, 60 pl di 100 mM glicina-HCl a pH 3,3 e 40 ml di 10 mg / ml in acqua ATP in una provetta e mescolare. Aggiungere 33 ml di collagene monomero (~ 3 mg / ml in 0,01 N HCl) nella provetta per microcentrifuga e mescolare. La soluzione deve essere limpida e incolore. Lasciare la provetta da microcentrifuga contenente la miscela di reazione a temperatura ambiente per 2 h. A questo punto, la soluzione apparirà ancora chiara, ma devecontengono principalmente collagene SLS. 4. Caratterizzazione AFM Fendere la superficie di un pezzo di mica attaccato ad un substrato AFM coprendo la superficie mica con un pezzo di nastro adesivo e poi peeling via. Controllare il nastro dopo per confermare che un intero strato di mica è stato tagliato in modo da ridurre le irregolarità sulla superficie e garantire che il campione precedente viene rimossa se la mica viene riutilizzato. Applicare 20 microlitri della soluzione di collagene fibrillare al substrato di mica appena spaccati. Lasciar riposare per 5 min. Delicatamente sciacquare soluzione di fibrille di collagene con l'acqua. Si consiglia di non applicare l'acqua direttamente sul centro del substrato di mica, ma al bordo e per consentirgli di fluire attraverso il campione. Asciugare la superficie con un leggero flusso di azoto. Si consiglia di dirigere il flusso al bordo e non al centro del substrato di mica. Sotto un microscopio ottico a 200 × ingrandimento,i campioni di collagene nativo e FLS dovrebbe mostrare macchie di fibrille. Collagene SLS non sarà visibile. Le caratteristiche uniche delle tre strutture diverse di collagene sono osservabili da AFM. In generale, noi immagine fibrille di collagene nativo con un AFM in modalità di contatto intermittente con silicio sonde AFM, mentre FLS e collagene SLS fibrille che tipicamente immagine con un AFM in modalità di contatto con nitruro di silicio sonde AFM. Lo facciamo perché di tempo e di considerazioni di costo. Silicon sonde AFM sono di solito più tagliente di nitruro di silicio sonde AFM, che li rendono particolarmente utili per l'imaging della struttura stretta strisce di fibrille di collagene nativo. Tuttavia, silicio sonde AFM sono molto più inclini alla contaminazione da campioni di collagene di nitruro di silicio sonde AFM e la necessità di sostituire frequentemente. Ci riserviamo pertanto l'uso di silicio sonde AFM per lo più per fibrille di collagene nativo di imaging in cui la risoluzione è una necessità maggiore e operiamo in modo intermittente a contatto prolong loro vita di utilità. Si consiglia un iniziale di 100 × 100 micron 2 scan che dovrebbe mostrare almeno un paio di costrutti di collagene. Da lì, lo zoom per eseguire la scansione di dimensioni di 10 × 10 micron 2 e poi 2 × 2 micron 2 per osservare la periodicità bande di collagene nativo e FLS, o le caratteristiche più sottili di un collagene SLS. E 'anche una buona idea controllare almeno due altre regioni sul campione collagene per verificare che le scansioni iniziali sono rappresentativi.

Representative Results

Collagene nativo La miscela di reazione di ~ 0,3 mg / ml di collagene monomero fosfato in 100 mM e 100 mM KCl a pH 7 sinistra a 37 ° C per 3-4 ore produrrà una soluzione contenente nativi fibrille di collagene di tipo trasparente con ~ 67 nm D-bande, senza fibrille unbanded. Sotto un microscopio ottico a 200 ingrandimenti ×, ciuffi di fibrille diverse possono essere normalmente visibile sul substrato di mica considerato segnatamente per contrasto interferenza differenziale (DIC) microscopio (Figura 2). In un tipico esempio, un caso 100 × 100 pm 2 scan da AFM di solito mostrano almeno un paio di fibrille che sono lunghe 5-50 micron (figure 3a-c). Individuale, separati da fibrille di collagene possono essere facilmente identificati in questa fase. Con un × 512 512 pixel 2 la scansione di immagini, lo zoom in un × 10 10 micron 2 dimensione scansione mostra che tutte le fibrille sono fasciato (figure 3d-f </strong>). Al fine di misurare con precisione la periodicità bande, è meglio lo zoom in un 2 × 2 pm 2 superficie di scansione (figure 3g-i). Bande periodicità può essere determinato semplicemente misurando media e la distanza longitudinale tra diversi picchi o valli. In alternativa, se il software AFM permette, una trasformata di Fourier unidimensionale lungo una sezione longitudinale può essere utilizzato. Figura 4 mostra una immagine AFM altezza di fibrille e una corrispondente sezione longitudinale. FLS collagene La miscela di reazione di 1 mg / ml μ1-acida e ~ 1 mg / ml in acqua monomero collagene lasciato a temperatura ambiente per 30 min produrrà una soluzione di fibrille di collagene FLS. Ciuffi di fibrille, analogamente a quanto si osserva nel caso di collagene nativo, può essere facilmente visibile sul substrato di mica sotto un microscopio ottico a 200 m ×agnification. In un tipico esempio, un caso 100 × 100 pm 2 scan da AFM di solito mostrano almeno un paio di fibrille. Con 512 × 512 pixel 2 dimensione dell'immagine di scansione, la periodicità bande può essere misurata con uno zoom a 10 × 10 micron 2 scan (Figura 5a), o più precisamente con un 2 × 2 um 2 scansione (figura 5b). Figura 5c mostra una sezione longitudinale di una fibrilla FLS. SLS collagene La miscela di reazione di 2 mg / ml e ATP ~ 0,5 mg / ml di collagene monomero in 100 mM glicina-HCl a pH 3,3 lasciata a temperatura ambiente per 2 h produrrà una soluzione di collagene SLS. Tipicamente, cristalliti SLS non saranno visibili al microscopio ottico. L'AFM è necessario per confermare la presenza di cristalliti SLS. In un tipico esempio, un caso 100 × 100 pm 2 scan da AFM di solito mostrano i moltipunti. Lo zoom in un × 10 10 micron 2 scan di solito mostrano diversi cristalliti SLS (Figura 6a). E 2 × 2 um 2 scan (Figura 6b) mostra la struttura più sottile di un cristallite SLS. Figura 1. Le tre forme strutturalmente diverse di fibrille di collagene che possono essere formati in vitro da monomero di collagene. Immagini AFM raffigurante monomero collagene e le tre maggiori strutture di collagene di ordine tutto su scala stesse dimensioni (2 × 2 micron 2). Figura 2. Immagine digitale a ~ 200 × ingrandimento di microscopia ottica in DIC di fibrille di collagene nativo di mica (a) intatta e (b) thresholded e affilata to evidenziare le fibrille. Figura 3. Immagini AFM di fibrille di collagene nativo di mica. Intermittenti contatti in modalità AFM ampiezza immagini vengono visualizzate. Figura 4. (A) 0,5 × 1 um 2 intermittente modalità immagine a contatto AFM altezza (scala verticale = 100 nm) e (b) sezione longitudinale di una delle fibrille di collagene nativo. Figura 5. Immagini AFM di fibrille di collagene FLS su mica. (A) 10 × 10 micron 2 contatto modalità immagine deflessione AFM, (b) 2 × 2 pm 2 contatto modalità immagine deflessione AFM e (c) longitudinalesezione trasversale di un collagene fibrillare FLS. Figura 6. Immagini AFM di collagene SLS di mica. Intermittenti contatti in modalità AFM ampiezza immagini vengono visualizzate.

Discussion

Purificato monomero collagene è stabile a pH basso e temperatura e la formazione di fibrille di collagene nativo coinvolge essenzialmente aumentare il pH e la temperatura della soluzione di monomero collagene. Le procedure per la ricostituzione di fibrille di collagene a banda di monomeri esistono da più di 50 anni. La procedura che il nostro laboratorio utilizzato nei nostri primi studi con il collagene 15 anni fa 7 è stato sulla base di procedure riassunte da Chapman e collaboratori nel 1986 10. Le condizioni per la formazione di fibrille di collagene che in lavori precedenti erano 0,18 mg / ml di collagene monomero in Na 2 HPO 4 / KH 2 PO 4 (I = 0,2, pH 7,4) tampone a 34 ° C. L'inconveniente di questa e di altre procedure che abbiamo provato è che ci sono sempre unbanded fibrille formate lungo le fibrille desiderati banda. Le nostre nuove condizioni sono ~ 0,3 mg / ml di collagene monomero fosfato in 100 mM e 100 mM KCl a pH 7 sinistra a 37 ° C per 3-4 ore. La procedura didure descritte nel presente documento si differenzia in ogni aspetto dalla procedura precedente per fare fibrille di collagene nativo. Ma la maggior parte notevolmente, abbiamo raddoppiato la forza ionica, aumentando la concentrazione del tampone e l'aggiunta di 100 mM KCl. L'aumento della forza ionica in formazione più coerente delle fibrille di collagene esclusivamente fasciato.

Nella nostra esperienza, le uniche volte che tale procedura non ha prodotto collagene nativo tipo di prodotto era quando la soluzione di monomeri di collagene era oltre la data consigliata dal costruttore, di utilizzo. In questo caso, ciò che si osserva varia da meno fibrille che sono tutti unbanded a fibrille molti ancora accertate ma prevalentemente unbanded. Si noti che monomero collagene scaduti spesso può ancora essere usato con successo per fare collagene nativo, ma quando fallisce, monomero nuovo collagene dovrebbe assolutamente essere acquistato.

FLS è stato identificato da Highberger et al 17. In preparati di collagene accreditati Orekhovich et al. 18. Ulteriori studi ha portato Highberger e Schmitt a concludere che si trattava di α1-glicoproteina acida, che promuove la formazione di FLS 12. Siamo stati poi in grado di replicare la procedura relativa alle collagene FLS combinando monomero collagene disponibile in commercio e α1-glicoproteina acida a pH basso e lentamente consentendo il pH ad aumentare di dialisi la miscela contro l'acqua per 24 ore 11. Presentiamo ora una modifica di tale procedura da dialisi monomero collagene contro acqua prima e semplicemente la combinazione con α1-glicoproteina acida in acqua per formare collagene FLS. Le condizioni per il collagene FLS montaggio qui descritte sono molto meno tempo. Il monomero collagene deve ancora essere pre-dializzato contro acqua, ma può essere fatto in massa e poi conservate a 4 ° C fino a quando non viene stabilmente utilizzato. Questo produce nuova procedura FLS prevalentemente fibrille di collagene a banda.

Dalla nostra esperienza, α1-acido glicoproteina con un più basso contenuto proteico combinata e acqua, e dal contenuto di zuccheri inferenza maggiore, è fondamentale per effettuare correttamente fibrille FLS. Noi di solito verificare con il produttore che l'α1-glicoproteina acida molto che usiamo ha un combinato% di contenuto di proteine ​​e di acqua di 82 o meno. E come con la procedura per la sintesi del collagene nativo, monomero collagene che è troppo vecchio può anche comportare la mancata produzione di collagene FLS. Inoltre, la purezza dell'acqua utilizzata per la dialisi è critico in questa procedura. Ad esempio, la dialisi contro collagene di monomero anche ~ 8 MΩ.cm anziché> 18 risultati MΩ.cm acqua in una soluzione di collagene che non si formerà collagene FLS.

Dei tre tipi di fibrille di collagene, il più facile da fare è il collagene SLS. La prima preparazione di SLS è stato descritto da Schmitt e collaboratori 15. Abbiamo pubblicato un adattamento di tale procedura 12 anni fa per la produzione di collagene SLS utilizzando coll disponibile in commercioagen 14. La procedura comporta semplicemente combinando 2 mg / ml ATP e 0,5 mg / ml di collagene nel monomero 0,05% (v / v) di acido acetico a pH 3,5, e lasciando la miscela a temperatura ambiente per una notte.

Nella nostra esperienza, l'aspetto critico di assemblaggio SLS che deve essere controllato è il pH della soluzione di reazione. SLS assemblati in più condizioni di base (~ pH 3,6-3,9) si traduce in ciuffi di aggregati cristallini. Condizioni più acide (pH ~ 2,9-3,2) si traduce in più sottili, cristalliti più separati rispetto a quelli montati nelle condizioni ideali di pH 3,3-3,5. PH di reazione fuori di questo intervallo (<2.8 e> 4) non danno alcun collagene SLS. In passato, abbiamo regolato il pH della miscela di reazione per aggiunta di acido acetico. Per semplificare la procedura ulteriormente, in questo manoscritto abbiamo introdotto una glicina-HCl per controllare il pH.

Le tre strutture di collagene diverse formate dai protocolli sopra descritti hanno caratterecaratteristiche teristiche che possono essere individuate da strumenti in grado di risoluzione nanometrica. Collagene nativo e FLS sono caratterizzati da bande periodicità di ~ 67 nm e circa 270 nm. La dimensione maggiore di collagene SLS è solo ~ 360 nm. Abbiamo descritto in particolare il modo in cui utilizzare un AFM per caratterizzare le tre strutture diverse di collagene. Tuttavia, qualsiasi operativo AFM a contatto o modalità contatto intermittente con qualsiasi sonda AFM avente <10 nm raggio dovrebbero anche essere in grado di immagine queste strutture collagene. Inoltre, microscopia elettronica può essere ed è stato utilizzato per caratterizzare tali strutture collagene 19.

Il principale vantaggio di queste procedure è che essi producono principalmente collagene desiderato costruire. L'unica altra forma di collagene che si trova in queste reazioni è il monomero di partenza, che spesso è visibile sullo sfondo delle immagini AFM. Nel caso di collagene nativo e FLS, possono essere facilmente separato dalla maggior parte del unreamonomero CTED per centrifugazione e lavaggio ripetuto del nativo risultante o FLS collagene pellet con acqua.

Abbiamo presentato procedure semplici e affidabili per rendere nativi, FLS e collagene SLS utilizzando avanzati, materiali di partenza commercialmente disponibili. Il monomero collagene utilizzato in tutte queste procedure è disponibile in commercio in una forma purificata. α1-glicoproteina acida e ATP sono entrambi disponibili in commercio.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vorremmo ringraziare tutti i numerosi precedenti universitari, dottorandi e post-dottorato che hanno contribuito con il loro tempo e fatica per lo studio della fibrogenesi collagene nel nostro laboratorio. Le scienze naturali e ingegneria Research Council del Canada ha costantemente fornito un finanziamento per i nostri studi di collagene.

Materials

Material/reagent Company Catalogue number Comments (optional)
Type I collagen monomer
(~3 mg/ml in 0.01 N HCl)		 Inamed
Advanced Biomatrix		 5409
5005-B		 Lot 1261443 (2.9 mg/ml, pH 2.1)
Lot 1629346 (3.2 mg/ml, pH 2.1)
Lot 6006 (3.2 mg/ml, pH 2.1)
ATP Research Biochemicals International A-141 Lot FBJ-1194A
α1-acid glycoprotein from bovine plasma Sigma-Aldrich G3643 Lot 051K7440 (89.8%)
Lot 011K7410 (82%)
Lot 065K7405 (71.2%)
Lot 063K7495 (71.9%)
Lot 117K7535 (75.9%)
(protein + water content)
a1-acid glycoprotein from human plasma Sigma-Aldrich G9885 Lot 128H7606 (70.9%)
Lot 049K7565V (68%)
(protein + water content)
mica Ted Pella 53
Pointprobe – Silicon SPM-Sensor Nanoworld NHC Silicon AFM probe that we use for intermittent contact mode
Veeco Nanoprobe Tips Veeco
(now Bruker AFM probes)		 NP-S Silicon nitride AFM probe that we use for contact mode
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Referencias

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In Vitro SynthesisNative CollagenFibrous Long Spacing CollagenSegmental Long Spacing CollagenExtracellular MatrixStructural ScaffoldingMechanical StrengthCollagen FibrilsBanding PeriodicityType I Collagen MonomersHierarchical AssemblyLength ScalesMicronsCommercially Available Collagen MonomerProtocolsMixtures Of StructuresUnbanded FibrilsImagingAtomic Force Microscope

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Loo, R. W., Goh, J. B., Cheng, C. C., Su, N., Goh, M. C. In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen. J. Vis. Exp. (67), e4417, doi:10.3791/4417 (2012).
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