Herstellung und Verwendung von Piggy-Back mehrgehäusigen Elektroden für<em> In vivo</em> Pharmakologische Manipulationen Neural Antworten

Ziehen Sie Glaselektroden Ziehen Sie Glaselektroden Ziehen einläufige Elektrode. Benutzen Barrel Glaskapillare mit Filament und Pull Spitze auf einen Durchmesser von etwa 1-2 Mikrometern Wellenlänge von 10-12 mm und entsprechend Elektrodenwiderstand von etwa 12 MOhm (Bereich 5-20 MOhm), gemessen in 0,9% NaCl-Lösung. Die untere Elektrode Widerstände würden in mehr Hintergrund-Aktivität führen und damit mehr Schwierigkeiten bei der Isolierung einheitlichen Aktivität von einzelnen Neuronen. Zum Ziehen diese Elektrode, verwenden Sie entweder eine horizontale oder eine vertikale Abzieher mit entweder Heizdrähte oder Heizschlangen. Ziehen Sie mehrgehäusigen Elektrode. Aufgrund der viel größeren Durchmesser mehrgehäusigen Glas und die Notwendigkeit der gleichmäßigen Wärmeverteilung über den gesamten mehrgehäusigen ist ein leistungsfähiges Abzieher mit einem größeren Durchmesser Heizwendel, nicht einer Heizwendel, benötigt. Ein mehrgehäusigen Pipette muss in der Mitte der Heizfaden mit n eingefügto der Heizwendel zu kontaktieren. Beachten Sie, dass neben den 5-Zylinder Pipetten hier beschrieben, sind 3-Barrel-oder 7-Barrel Pipetten kommerziell erhältlichen Alternativen. Ziehen Glas mit einer Pipettenspitze von etwa 10 Mikrometern Gesamtdurchmesser oder weniger. Die Spitze auf den richtigen Durchmesser in dem nächsten Schritt wird zerbrochen, so dass die genaue Größe der Spitze weniger kritisch ist während des Ziehvorgangs über die gesamte Form der Elektrodenspitze, die lang und relativ dünn sollte. Siehe das Bild in 1C für die gewünschte Elektrodenspitze Form. Kurze und stubby Elektrodenformen (1B) verursacht eine beträchtliche Menge von Gewebeschäden, wenn in das Gehirn vorgeschoben, während sehr langen und dünnen Elektrodenformen (1A) sich biegen und somit wird es schwierig, die Elektrodenspitze zum richtigen brechen Durchmesser (siehe Schritt 2). Ändern Electrode Tipps Ändern Elektrodenspitzen. Bevor die beiden Elektroden können miteinander verklebt werden, Sie müssen modifiziert werden. Die Welle des einzelnen Elektrode muss gebogen, bevor es dem mehrgehäusigen sicherstellen, dass die kombinierte Welle der fertigen Huckepack-Elektrode ist so dünn wie möglich angebracht werden kann. Zusätzlich hat die Spitze der Elektrode mehrgehäusigen abgebrochen werden, um mit geringem Widerstand für die Iontophorese gewährleisten. Verbiegen Welle einer einzigen Trommel-Elektrode um etwa 20 Grad. Verwendung der kleinsten Bunsenbrennerflamme möglich. Typische "kleinen" Bunsenbrenner von Standard Labornetzteil Unternehmen schaffen Flamme Größen, die viel zu groß für diese Anwendung sind. Um dieses Problem zu umgehen verwenden kleinste Bunsenbrenner und sichern eine Spritzennadel (~ 18 Gauge) an die Oberseite des Brenners, und Abdichten der Verbindung unter Verwendung Dentalzement. Wenn betrieben, sollte die Flamme schwierig zu sehen sein, etwa 5 mm oder weniger im Durchmesser und etwa 8 mm hoch. Jede Luftbewegung im Raum, dass die Flamme zu löschen, so ist es eine gute Idee, um den Brenner in Betriebgeschlossenen Raum oder Windschutz verwenden. Bewegen des einzelnen Barrel-Elektrode durch die Flamme, um es um etwa 20 Grad biegt. Darauf abzielen, die Brennerflamme Schmelzen des Glases bei den Übergangsbereich bei etwa 10 Millimeter entfernt von der Elektrodenspitze. Um zu vermeiden, Schmelzen der Spitze der Elektrode wir vor, dass die Elektrode bei etwa 45 Grad statt, Spitze nach unten und bewegen die Elektrode durch die Flamme relativ schnell. Brechen Sie die Spitze des mehrgehäusigen Elektrode. Um visuelle Kontrolle zu gewährleisten und gleichzeitig bricht der Elektrodenspitze, ein Mikroskop mit einem Minimum Objektiv 10x und 10x Okulare. Ein Mess-Skala im Okular eingelegt wird auch benötigt, um Düsengrößen messen. Befestigen eines Stückes aus Plexiglas mit dem Mikroskop, dass das Ende des Plexiglas in etwa ein Drittel kann zu einer Hälfte des Sichtfeldes des Mikroskops gesehen werden. In unserem Fall ist das Plexiglas Stück ca. 25 x 70 mm und 5 mm dick und die angeschlossenen über eine Schraube, die in einem benutzerdefinierten gesichert werden kannmachte Thread im Mikroskoptisch. Es ist wichtig, ein Design, das für das Bewegen Plexiglas unabhängig von dem Schlitten ermöglicht haben. Legen Sie die mehrgehäusigen Elektrode in einem Bett aus Knetmasse auf einem Glasträger, und legen Sie die Folie mit der Elektrode in der Mikroskoptisch den Diahalter. Mit dem Mikroskoptisch der xy-Manipulatoren, sanft bewegen die Elektrodenspitze gegen den Plexiglas Stück, und beobachten Sie das Brechen der Spitze durch das Mikroskop Okulare. Versuchen Sie, sauber brechen die mehrgehäusigen Geheimtipp zu einer kumulativen Durchmesser von etwa 25-35 Mikrometer. Entsorgen Pipetten mit Spitzendurchmessern, die brach zu groß ist, oder Tipps mit ungleichen Pausen. Wir verwerfen etwa 30% unserer mehrgehäusigen Elektroden aufgrund unerwünschter Spitzenformen. Montieren Piggy-Back-Elektrode Montieren Huckepack-Elektrode. Position Elektroden. Entfernen Plexiglas Stück in Schritt 2,2 aus dem Mikroskop Stufe eingesetzt. Sichern abgeschlossenmehrgehäusigen Elektrode in Knetmasse auf einem Glasträger, Spitze leicht nach oben zeigt. Aufwärts zeigt steht Schritt 3.2, das Kleben der beiden Elektroden wichtig. Tipps, die nach oben zeigen bewirken, dass der Kleber zu laufen weg von der Spitze, die Vermeidung Kleben Sie die Elektroden Tipps. Legen gebogene Single Barrel Elektrode in Elektrodenhalter der maßgeschneiderten Mikromanipulator (Abbildung 2). Mit visuellen Führung und dann mikroskopische Führung, senken Sie die Single Barrel Elektrode auf der mehrgehäusigen Elektrode. Die einzelne Elektrode sollte direkt in die Nut, die durch die Anordnung der 5 Fässer gebildet wird, mit seiner Spitze hervorstehenden die Spitze des mehrgehäusigen Spitze von ca. 5-10 Mikrometer verringert werden. Beim Absenken des einzigen Lauf, genau zu beobachten, die den Winkel zwischen den beiden Elektroden gebildet ist. Für beste Ergebnisse vermeiden Winkeln in der die Spitzen weisen voneinander, sondern versucht, die einzelne Elektrode auf der Multi abzusenken perfekt parallel oder sogar mit seiner SpitzeBerühren des mehrgehäusigen ersten bildet eine sehr geringe "Keil" Anordnung. Da die einzelnen Barrel Spitze sehr flexibel ist, wird er sich verbiegen, wenn die einzelne Elektrode etwas weiter ist, nachdem die Spitze die Oberfläche des Zylinders mit mehreren Elektroden erreicht hat abgesenkt, wodurch ein sauberes zusammengesetzter Spitze, die eine kleine Menge an Federwirkung gebaut hat das hilft halten die Spitzen zusammen. Wenn jedoch der Winkel zwischen den einzelnen Lauf und mehrgehäusigen Elektrode zu steil ist (zu viel von einem Keil), wird die Federwirkung zu hoch und biegen die Elektrodenanordnung nach unten. Kleber Elektrode Wellen zusammen. Kleben Sie die Wellen der beiden Elektroden zusammen mit Cyanacrylat (Sekundenkleber). Setzen Sie einen kleinen Tropfen Klebstoff auf die kleine Seite eines flachen Zahnstocher und Touch-Elektroden-Einheit mit dem Leim fallen. Beginnen Sie an der Position am weitesten distal der Tipps und langsam bewegen Zahnstocher mit Leim Tropfen entlang Elektrode Wellen in Richtung der Elektrode Tipps. Mit zu viel Leim oder Auftragen von Leim too nahe den Elektrodenspitzen wird Verkleben der Elektrode Öffnungen führen, wodurch die Elektrode zumindest teilweise nicht funktionsfähig. Stabilisieren Gelenk mit Zahnzement. Mischen einer kleinen Menge Dentalzement und zahnmedizinischen Acrylsäure in einem kleinen Einweg-Kunststoff-Schale oder Wiegeschiffchen, mit einem flachen Zahnstocher. Warten Sie, bis Zement wird formbar und eine kleine Menge auf die Verbindung zwischen den beiden Elektroden, die gemeinsame (pink Material in Abbildung 3) zu stabilisieren. Lassen Sie etwa 15 min zu trocknen. Entfernen und aufbewahren Elektrode. Entfernen Sie vorsichtig das ausgefüllte Huckepack-Elektrode zunächst aus dem Mikromanipulator Halter, und dann lösen sich von der Glasplatte, und an einem staub-Container. Bereiten Electrode Fill-Lösungen Planen Elektrode Füllung Lösungen. Da Iontophorese erfordert geladene Moleküle haben die meisten Wirkstoffe entweder im sauren oder alkalischen Milieu (typischerweise ein gelöst werdenta pH von etwa 3-4, oder einen pH von etwa 8-10, jeweils). Eine Anzahl von Chemikalien, die oft in Iontophorese verwendet werden, sind in Tabelle 1 aufgelistet. Für Wirkstoffe, die nicht in der Tabelle aufgelistet sind, aus der pKa-Wert zu bestimmen, ob es einfacher wäre, um das Molekül in einer sauren oder einer alkalischen Umgebung bei, um das Molekül eingebracht und dementsprechend aufzulösen. Für beste Ergebnisse, mischen alle Lösungen täglich frisch. Füllen und Vorbereiten Elektroden Füllen Sie und bereiten Elektroden. Kurz vor Verwendung der Elektrode, Back-füllen jedes Fass mit ihren jeweiligen Droge, mit Kohlefaser 28 bis 34 Gauge-Nadeln an Spritzen mit Spritze Filter. Füllen Sie die 4 äußeren Barrel der 5-Zylinder-Konfiguration mit den Mittel der Wahl, und dem Zentrum Lauf mit 3M NaCl als Ausgleich Barrel. Füllen Sie den Single Barrel Aufnahme-Elektrode mit 3M NaCl als gut. Zugeben eines Farbstoffs zu der NaCl-Lösung, wie schneller grün oder Phenolrot wird es leichter, die Elektrodenspitze s.während der Platzierung der Elektrode auf der Oberfläche des Gehirns. Legen Sie die Elektrode in den Elektrodenhalter des Aufnahme-Setup und legen Sie alle Kabel in die entsprechenden Glas-Fässern. Verwenden Sie isolierte Silberdraht von denen etwa 1 cm der Isolierung an der Spitze entfernt wurde. Es sollte 5 Leitungen für die mehrgehäusigen Elektrode (4 Droge Fässer und ein Auswuchten Barrel), plus dem Verstärker Draht, der in die Aufnahme einläufige Elektrode eingesetzt werden muss. Schalten Sie Iontophorese Pump Module Schalten Sie Iontophorese Pumpmodule und testen Sie alle Fässer. Die Elektrode Testfunktion jeder Pumpe Modul hilft festzustellen, ob die Elektrode Barrel funktionsfähig ist. Um ein Auslaufen der Medikamente aus den Fässern zu verhindern, wenn nicht in Gebrauch ist, muss eine Haltespannung in die entgegengesetzte Polarität wie die Ladung auf Molekül angewendet werden.