Fabrication et utilisation de ferroutage Multibarrel Électrodes pour<em> In vivo</em> Manipulations pharmacologiques des réponses de neurones

Tirez électrodes de verre Tirez électrodes de verre Tirer électrode seul barillet. Utilisation verre cylindre unique capillaire avec filament et retirer la pointe à un diamètre d'environ 1-2 micromètres, longueur d'arbre de 10-12 mm, et la résistance d'électrode correspondante d'environ 12 MOhm (gamme 5-20 MOhms) telle que mesurée dans une solution de NaCl 0,9%. Résistances électrode inférieure se traduirait par une plus grande activité de fond et de la difficulté à isoler donc plus l'activité unitaire des neurones individuels. Pour tirer cette électrode, utilisez horizontale ou verticale avec un extracteur de filaments de chauffage soit des serpentins de chauffage. Tirez électrode multibarrel. Grâce au diamètre beaucoup plus grand de verre multibarrel et la nécessité d'une répartition uniforme de la chaleur autour de la multibarrel ensemble, un extracteur puissant avec un serpentin de chauffage de plus grand diamètre, pas un filament de chauffage, est nécessaire. Une pipette multibarrel doit être inséré dans le centre du filament de chauffage avec no communiquer à la bobine de chauffage. Notez que, outre les pipettes 5-baril décrit ici, pipettes 3-7-tonneau ou fût existe des alternatives disponibles dans le commerce. Retirer le verre à une extrémité de la pipette d'environ 10 micromètres de diamètre total, ou moins. La pointe est cassée au diamètre correct dans l'étape suivante, de sorte que la taille de la seringue exacte est moins critique au cours de l'opération de traction de la forme globale de la pointe de l'électrode, qui doit être long et relativement mince. Reportez-vous à l'image de la figure 1C pour la forme de la pointe d'électrode souhaité. Formes d'électrodes courtes et trapues (figure 1B) provoquera une quantité importante de lésions des tissus lorsqu'elles sont avancées dans le cerveau, tandis que les formes d'électrodes très longues et minces (figure 1A) se plie et ainsi, il sera difficile de briser la pointe de l'électrode à la bonne diamètre (voir étape 2). Modifier Conseils électrodes Modifier pointes des électrodes. Avant que les deux électrodes peuvent être collées ensembleIls doivent être modifiées. La tige de l'électrode unique doit être plié avant d'être attaché à la multibarrel pour s'assurer que le combiné de l'arbre fini piggy-back électrode est aussi mince que possible. En outre, la pointe de l'électrode doit être multibarrel rompues afin d'assurer une faible résistance pour ionophorèse. Plier l'arbre de barillet d'une électrode unique d'environ 20 degrés. Utilisation de la flamme du brûleur Bunsen plus petite possible. Typiques "petits" becs Bunsen de laboratoire standards sociétés d'approvisionnement créer des tailles de flamme qui sont bien trop grande pour cette application. Pour contourner ce problème, utilisez le brûleur Bunsen petit commerciale et d'assurer une aiguille de seringue (~ 18 gauge) sur le dessus du brûleur, et sceller la connexion en utilisant du ciment dentaire. Lorsqu'il est utilisé, la flamme devrait être difficile à voir, d'environ 5 mm de diamètre ou moins, et environ 8 mm de hauteur. Tout mouvement d'air dans la salle s'éteint la flamme, c'est donc une bonne idée pour faire fonctionner le brûleur dans unchambre fermée, ou à utiliser des boucliers de vent. Déplacer l'électrode unique canon à travers la flamme de le plier d'environ 20 degrés. Viser la flamme du brûleur de la fusion du verre dans la zone de transition à environ 10 millimètres de distance de l'extrémité de l'électrode. Pour éviter de faire fondre la pointe de l'électrode de nous suggérons que l'électrode se tiendra à environ 45 degrés, la pointe dirigée vers le bas et déplacer l'électrode à travers la flamme relativement rapidement. Casser la pointe de l'électrode multibarrel. Afin d'assurer un contrôle visuel tout en brisant la pointe de l'électrode, utiliser un microscope avec un objectif minimum de 10x et 10x oculaires. Une échelle de mesure inséré dans l'oculaire seront également nécessaires pour mesurer les tailles de buses. Fixer un morceau de plexiglas au microscope de telle sorte que l'extrémité de la plexiglas peut le voir sur environ un tiers à une moitié de champ de vision du microscope. Dans notre cas, la pièce de plexiglas est d'environ 25 x 70 mm et 5 mm d'épaisseur et joint par l'intermédiaire d'une vis qui peut être fixé dans une mesureles threads dans la platine du microscope. Il est important d'avoir un design qui permet de plexiglass se déplacer indépendamment de la diapositive. Placer l'électrode multibarrel dans un lit de pâte à modeler sur une lame de verre, et insérer la diapositive contenant l'électrode dans le support de diapositives étape microscope. Utilisation des manipulateurs xy le stade microscope, déplacez doucement le bout de l'électrode sur la pièce de plexiglas, et d'observer la rupture de la pointe à travers les oculaires du microscope. Tenter de briser proprement la pointe de la multibarrel à un diamètre cumulé de environ 25-35 micromètres. Jeter pipettes avec des diamètres de pointe, qui s'est détachée trop grande, ou des conseils avec des pauses inégales. Nous écartons environ 30% de nos électrodes multibarrel en raison de formes de pointe indésirables. Assemblez Piggy-back électrode Assemblez piggy-back de l'électrode. Position des électrodes. Retirer la pièce de plexiglas utilisé à l'étape 2.2 de la platine du microscope. Fixez terminéemultibarrel électrode dans la pâte à modeler sur une lame de verre, pointe dirigée légèrement vers le haut. Pointant vers le haut sera important pour l'étape 3.2, le collage des deux électrodes. Conseils qui pointent jusqu'à provoquer la colle à s'enfuir de la pointe, en évitant le collage des pointes des électrodes. Insérez le baril électrode coudée unique en porte-électrode du micromanipulateur sur mesure (Figure 2). En utilisant un guidage visuel d'abord, puis d'orientation microscopique, abaisser l'électrode seul baril sur l'électrode multibarrel. L'électrode unique devrait être abaissé directement dans la rainure qui est formée par la disposition des canons 5, avec son extrémité faisant saillie de l'extrémité de la pointe multibarrel d'environ 5-10 micromètres. Lors de l'abaissement du cylindre unique, observer attentivement l'angle qui est formé entre les deux électrodes. Pour éviter les meilleurs résultats angles dans laquelle les pointes pointes en dehors de l'autre, mais plutôt tenter d'abaisser l'électrode unique sur le multi parfaitement parallèle ou même avec sa pointetoucher le multibarrel d'abord, la formation d'agencement, une très légère «écart». Depuis la pointe du cylindre unique est très flexible, il se plie lorsque l'électrode unique est descendu un peu plus loin après que la pointe a atteint la surface supérieure de l'électrode baril multiples, formant une pointe propre composite qui a une petite quantité de l'action du ressort intégré qui permet de tenir les pointes ensemble. Toutefois, si l'angle entre le canon unique et électrode multibarrel est trop raide (trop de coin), l'action du ressort sera trop élevé et plier vers le bas arrangement d'électrodes. Coller ensemble d'électrodes arbres. Collez les arbres des deux électrodes ainsi que l'aide de cyanoacrylate (superglue). Placer une petite goutte de colle sur le petit côté d'un cure-dent plat et assemblage d'électrodes contact avec la goutte de colle. Commencer à la position la plus distale des conseils et déplacer lentement cure-dent avec une chute de colle le long des arbres électrodes vers les pointes des électrodes. Avec de la colle trop, ou appliquer de la colle too à fermer les extrémités des électrodes se traduira par collage les ouvertures d'électrodes, ce qui rend l'électrode au moins partiellement non fonctionnel. Stabiliser joint avec du ciment dentaire. Mélangez une petite quantité de ciment dentaire et acrylique dentaire dans un petit plat en plastique jetable ou peser bateau, à l'aide d'un cure-dent plat. Attendez jusqu'à ce que le ciment devient malléable et appliquez une petite quantité de l'articulation entre les deux électrodes pour stabiliser l'articulation (matériau rose dans la figure 3). Prévoyez environ 15 minutes pour sécher. Retirez et rangez électrode. Retirez délicatement le achevée piggy-back première électrode du porte-micromanipulateur, puis détacher de la lame de verre, et conserver dans un récipient étanche à la poussière. Préparer des solutions de remplissage pour électrodes Préparer électrode solutions de remplissage. Depuis iontophorèse nécessite molécules chargées, la plupart des agents doivent être dissous soit dans un environnement acide ou alcalin (généralement unta pH d'environ 3-4, ou un pH d'environ 8-10, respectivement). Un certain nombre de produits chimiques qui sont souvent utilisés en ionophorèse sont énumérés dans le tableau 1. Pour les agents qui ne sont pas répertoriés dans le tableau, déterminer à partir de la valeur du pKa, que ce serait plus facile d'utiliser la molécule dans un milieu acide ou en milieu alcalin pour maintenir la molécule chargée, et se dissolvent en conséquence. Pour de meilleurs résultats, mélangez toutes les solutions frais tous les jours. Remplir et préparer des électrodes Remplissage et préparation des électrodes. Juste avant d'utiliser l'électrode, remblais chaque baril avec son médicament concerné, à l'aide de fibre de carbone 28 – 34 aiguilles de calibre attachés à des seringues avec des filtres seringues. Remplir les 4 barils extérieures de la configuration 5-canon avec les médicaments de choix, et le canon central avec NaCl 3M comme un baril d'équilibrage. Remplir l'électrode à canon unique d'enregistrement avec NaCl 3M ainsi. Ajout d'un colorant à la solution de NaCl, comme le rouge de phénol vert ou rapide, il sera plus facile de voir la pointe de l'électrodelors de la pose de l'électrode sur la surface du cerveau. Insérer l'électrode dans le porte-électrode de la configuration de l'enregistrement et insérer les fils dans les fûts de verre appropriées. Utilisez un fil isolé d'argent, à environ 1 cm d'isolant a été retiré à la pointe. Il doit y avoir des fils 5 de l'électrode multibarrel (4 barils de médicaments et un baril d'équilibrage), ainsi que le fil de l'amplificateur qui doit être insérée dans le barillet électrode d'enregistrement unique. Allumez Modules pompe iontophorèse Allumez modules de pompe iontophorèse et tester tous les fûts. La fonction de test d'électrode de chaque module de pompe aidera à déterminer si le canon électrode est fonctionnel. Pour empêcher la fuite des médicaments à partir des fûts lorsqu'il n'est pas utilisé, une tension de maintien de la polarité opposée à celle de la charge molécule doit être appliqué.