Için Multibarrel Elektrodları Üretim ve Piggy-back kullanma<em> In vivo</emSinir Cevaplarının> Farmakolojik Çarpıtmalar

Cam elektrotlar çekin Cam elektrotlar çekin Tek beşik elektrot çekin. Filamanlı kapiller tek beşik camını kullanın ve ölçülen yaklaşık 1-2 mikrometre, 10-12 mm şaft uzunluğu ve yaklaşık 12 MOhm karşılık gelen elektrot direnci (aralık 5-20 MOhms) bir çapa ucu çekin % 0.9 'luk NaCl çözeltisi içinde. Alt elektrot dirençleri daha fazla arka plan aktivitesi ile sonuçlanabilir ve bireysel nöronların üniter aktivite yalıtma dolayısıyla daha zor olurdu. Bu elektrot çekme için, ısıtma rezistanslarının ya da ısıtma bobinleri ya da birlikte bir yatay ya da dikey ya da çekici kullanır. Multibarrel elektrot çek. Multibarrel camın çok daha büyük bir çap ve tüm multibarrel etrafında eşit bir ısı dağılımı olan ihtiyacı nedeniyle, daha büyük çaplı bir ısıtma bobini, bir ısıtma filaman, güçlü bir çektirme gereklidir. Bir pipet multibarrel n ile ısıtma filaman merkezinden yerleştirilmiş olması gerekiro ısıtma bobini ile temasa geçiniz. Bunun yanında, 5-namlu pipetler burada açıklanan dikkat ediniz, 3-varil ya da 7-varil pipetler ticari olarak temin alternatiflerdir. Yaklaşık 10 mikrometre toplam çapı, ya da daha az bir pipet cam çekin. Ucu, bir sonraki adımda doğru çapına kırık, bu nedenle uç tam boy uzun ve nispeten ince olması gerekir elektrot ucu genel şekle göre, daha çekme işlemi sırasında daha az kritiktir. İstenilen elektrot ucu şekil için Şekil 1C yılında resme bakın. Çok uzun ve ince elektrot şekiller (Şekil 1A) viraj olacak ve böylece zor doğru için elektrot ucu kırmak için yapacak ise kısa ve küt elektrot şekiller (Şekil 1B), beyin içine ilerletilir doku hasarı önemli miktarda neden olur çap (adım 2). Elektrot ipuçları Değiştir Elektrot uçları değiştirin. Iki elektrot birbirine yapıştırılmış olabilir önce, Bunlar modifiye edilmesi gerekir. Tek bir elektrot arasında şaft da bitmiş domuz geri elektrot bileşik şaft mümkün olduğu kadar ince olduğundan emin olmak için multibarrel eklenebilir önce bükülmüş gerekmektedir. Buna ek olarak, multibarrel elektrot ucu iyontoforez için düşük direnç sağlamak için kesilmek sahiptir. Yaklaşık 20 derecelik tek bir varil elektrot mili bükün. Mümkün olan en küçük Bunsen beki alev kullanın. Standart laboratuar tedarik şirketlerinin tipik "küçük" Bunsen brülör bu uygulama için çok büyük alev boyutları oluşturabilirsiniz. Bu sorunu küçük ticari Bunsen beki kullanmak ve brülör üstüne bir şırınga (~ 18 gauge) güvenli ve diş çimento kullanarak bağlantı mühür aşmak için. Çalıştırılırken, alev çapı 5 mm ya da daha az, yaklaşık 8 mm uzunluğunda ve yaklaşık görmesi zor olması gerekir. Odada herhangi bir hava hareketi o alev sönecektir, bu yüzden de brülör çalıştırmak için iyi bir fikirdirkapalı bir odada, ya da rüzgar kalkanları kullanın. Yaklaşık 20 derece bükün için alev aracılığıyla tek beşik elektrodu taşıyın. Brülör alevi uzak elektrot ucu yaklaşık 10 milimetre geçiş alanı, cam eritmek için hedefleyin. Ucu aşağı doğru, biz elektrot yaklaşık 45 derecelik düzenlenecek öneririz elektrodun ucunda erime önlemek ve nispeten hızlı bir alev ile elektrot taşımak için. Multibarrel elektrot ucu kesiyorum. Elektrot ucu kırarak, en az 10x objektif ve 10x oküler ile mikroskop kullanırken görsel kontrolü sağlamak için. Oküler takılı bir ölçme skalası da meme boyutlarını ölçmek için gerekli olacaktır. Pleksiglas uç mikroskop görüş alanının bir buçuk katı kadar yaklaşık üçte-biri görülebilir bu tür mikroskop ile pleksiglas bir parça ekleyin. Bizim durumumuzda, pleksiglas parçası özel olarak güvence altına alınabilir bir vida ile 25 x 70 mm ve kalın ve ekli 5 mm dirmikroskop aşamasında iplik yapılır. Bu pleksiglas bağımsız slayt taşımak için izin veren bir tasarıma sahip olmak önemlidir. Bir cam slayt üzerine kil modelleme bir yatakta multibarrel elektrot yerleştirin ve mikroskop sahne adlı slayt tutucu içine elektrot içeren slayt eklemek. Mikroskop sahne en xy manipülatörler kullanarak yavaşça pleksiglas parçası karşı elektrot ucu taşımak ve mikroskop Okülerin aracılığıyla ucunun kırılması gözlemlemek. Temizce yaklaşık 25-35 mikrometre kümülatif çapı multibarrel ucu kırmaya çalışın. Düzensiz aralıklarla çok büyük, ya da ipuçları kesti ucu çapı pipetler atın. Biz istenmeyen ucu şekilleri nedeniyle bizim multibarrel elektrotlar yaklaşık% 30 atın. Piggy-back Elektrot Assemble Piggy-back elektrot birleştirin. Pozisyon elektrotlar. Mikroskop aşamasından adım 2.2 'de kullanılan pleksiglas parçasını çıkarın. Tamamlanmış Güvenlibir cam slayt üzerine kil modelleme içine multibarrel elektrot, hafifçe yukarı doğru işaret ipucu. Yukarı İşaret adım 3.2, iki elektrot yapıştırma için önemli olacaktır. Yukarı işaret İpuçları tutkal yapıştırma elektrot uçları kaçınarak, ucu kaçmak neden. Ölçüye mikromanipülatör (Şekil 2) elektrot tutucu içine bükülmüş tek beşik elektrodu takın. Birinci ve daha sonra mikroskobik kılavuz görsel kılavuz kullanarak, multibarrel elektrot üzerine tek bir namlu elektrot düşürmektedir. Tek bir elektrot yaklaşık 5-10 mikrometre ile multibarrel ucu uç çıkıntı ucu ile birlikte, 5 varil düzenleme ile oluşturulan oluk içine direkt olarak azaltılabilmektedir. Tek bir namlu alçaltılırken, yakından iki elektrot arasında oluşan açı dikkate alınmalıdır. En iyi sonuç ipucu birbirinden işaret etmektedir, ancak daha ziyade tek bir elektrot üzerine düşürmek için çalışır ki içinde, her açıdan önlemek için çok mükemmel bir şekilde paralel veya düz ucu ileÇOK hafif 'kama' düzenlemesi oluşturan, ilk multibarrel dokunmadan. Tek bir namlu ucu çok esnek olduğundan, yay içinde yapılmış bir eylem az miktarda bir temiz bir bileşik uç oluşturan uç çoklu namlu elektrot üst yüzeyi ulaştıktan sonra tek bir elektrot biraz daha indirildiği zaman bükülür Birlikte ipuçları tutarak yardımcı olur. Tek bir namlu ve multibarrel elektrot arasındaki açı (a kama çok fazla) çok dik Bununla birlikte, eğer, yay etkisi çok yüksek olması ve elektrot düzenlemesi aşağı doğru bükülür. Birlikte Tutkal elektrot milleri. Tutkal birlikte iki elektrot milleri kullanarak siyanoakrilat (yapıştırıcı). Tutkal damla ile düz bir kürdan ve dokunmatik elektrot montaj küçük yüzüne tutkal küçük bir düşüş yerleştirin. Ipuçları en distal pozisyonda başlayın ve yavaşça elektrot uçları doğru elektrot miller boyunca tutkal damla ile kürdan taşıyın. Çok fazla tutkal kullanarak, ya da yapıştırıcı t uygulayarakelektrot uçları için oo yakınında en azından kısmen işlevsiz hale elektrot, tutkallama elektrot açıklıklar neden olur. Diş çimento ile eklemini stabilize., Küçük bir tek kullanımlık plastik tabak, diş çimento ve diş akrilik az miktarda karıştırın veya düz bir kürdan kullanarak, tekne tartın. Çimento moldable hale gelene kadar bekleyin ve eklem (Şekil 3 pembe materyal) stabilize iki elektrot arasındaki eklem az miktarda uygulayın. Yaklaşık 15 dakika kurumasını bekleyin. Elektrot çıkarın ve saklayın. Dikkatlice mikromanipülatör sahibinden ilk tamamlanmış piggy-back elektrot kaldırmak ve sonra cam slayt ayırmak ve toz geçirmez bir kapta saklayın. Elektrot Dolgu Çözümleri hazırlayın Elektrot dolgu çözümleri hazırlayın. İyontoforez yüklü moleküllerin gerektirdiğinden, en madde bir asidik ya da bazik bir ortamda (tipik olarak bir ya da çözünmüş olması gerekirsırasıyla ta yaklaşık 3-4 arasında pH, ya da 8-10 arasında bir pH değerine). Sık sık iyontoforez olarak kullanılan kimyasal bir dizi Tablo 1 'de listelenmiştir. Tabloda yer almayan maddeler için, bu molekülü ücret tutmak için bir asidik veya alkali bir ortamda molekül kullanmak daha kolay olabilir ve buna göre çözülür edip, pKa değeri belirler. En iyi sonuçlar için, günlük tüm çözümleri taze karıştırın. Dolgu ve Elektrotları hazırlayın Doldurun ve elektrotlar hazırlar. Şırınga filtreleri ile şırınga bağlı 34 gauge iğne – Sadece elektrot kullanmadan önce, karbon fiber 28 kullanılarak, ilgili ilaç ile her bir varil geri doldurun. Tercih edilen ilaçlar, ve dengeleyici bir varil olarak 3M NaCl ile merkez namlu ile 5-varil konfigürasyonu 4 dış varil doldurun. Sıra 3M NaCl ile tek beşik kayıt elektrot doldurun. Böyle hızlı yeşil veya fenol kırmızısı gibi, NaCl bir boya ekleme daha kolay elektrot ucu görmek için yapacaktırbeyin yüzeye elektrot yerleştirme esnasında. Kayıt kurulum elektrot tutucu içine elektrot takın ve uygun cam varil içine tüm kabloları takın. Yalıtım yaklaşık 1 cm ucunda kaldırıldığı izole gümüş tel kullanın. Multibarrel elektrot (4 ilaç varil ve bir dengeleme namlu), artı elektrot kayıt tek bir varil içine takılması gerekir amplifikatör için tel 5 tel olmalıdır. İyontoforez Pompa Modüller açın İyontoforez pompa modülleri açın ve tüm varil sınayın. Her pompa modülü elektrot test fonksiyonu elektrod varil fonksiyonel olup olmadığını belirlemenize yardımcı olur. Kullanılmadığı, molekül ücret olarak zıt kutuplu bir tutma gerilimi gerektiğinde varil ilaçların sızıntısını önlemek için.