オリゴペプチドの気相酸性度の決定

アミノ酸残基の酸性度は、構造体に影響を与える最も重要な熱化学的性質、反応性、およびタンパク質^9,19の折りたたみ展開プロセスの一つである。個々のアミノ酸残基は、しばしば、タンパク質のそれらの位置に応じて異なる有効な酸性度を示す。具体的には、活性部位に位置して残基はしばしば展示が大幅に酸性度を摂動。その一例は、酵素^20,21のチオレドキシンスーパーファミリーの活性部位に存在するシステイン残基である。活性部位のシステインは、タンパク質^3-5展開のものに比べて異常に酸性である。それはらせん構造が変わった酸性度に大きく貢献を有し得ることが示唆されている。特に、水溶液中^2,6-8で、溶液中で行わペプチドの酸-塩基特性について鋭意実験研究がある。結果は、多くの場合、溶媒効果によって複雑にされた^7。実際には、蛋白質中の活性部位のほとんどは溶媒効果は^9,10最小化される内部領域の近くに配置されている。

ペプチドおよびタンパク質の固有の酸 – 塩基の特性を理解するためには、溶媒のない環境での試験を行うことが重要である。ここでは、気相酸性度の測定のための質量分析ベースの方法をご紹介します。アプローチは、拡張されたコックの運動方法と呼ばれる。この方法は、正常に^、例えば気相酸性度、プロトン親和力、金属イオンアフィニティー、電子親和力およびイオン化エネルギー^11-15等の各種熱特性の測定のための化学系の広い範囲に適用されている^22-26。私たちは、オリゴシステインポリアラニンとシステインポリグリシンペプチド^17,18,27の一連の気相酸性度を決定するためにこの方法を適用している。これらの研究は、N-末端システインpeptidことを示しているエスは、対応するC-末端のものよりも著しく酸性である。前者の高い酸性度は、おそらくチオレートアニオンが強くらせんマクロ双極子との相互作用により安定化された螺旋状の立体構造の影響によるものである。なぜならペプチドの非揮発性および熱的に不安定な性質のため、運動方法は、ペプチド²⁸のかなり正確な酸塩基熱の量を生成するために、現時点で入手可能な最も実用的なアプローチである。

一般的なスキームと運動メソッドに関連付けられた式は、 図1に示されている。ペプチドの気相酸性度の決定は、（AH）プロトン結合型クラスターアニオンの一連の形成から始まり、[A•H•A _i]が ¯（または[A¯•H ^+•A _I¯] ¯）、¯¯と_私は、ペプチドの脱プロトン化形態である質量分析計のイオンソース領域、およびそれぞれ基準酸である。基準酸は公知の気相酸性度を有する有機化合物である。基準酸は、互いに類似した構造を有するべきである（ただし、ペプチドのものと必ずしも同様）。参照核酸間の構造の類似性は、それらの間の脱プロトン化のエントロピーの類似性を保証します。プロトン結合型クラスタ 陰イオンは質量選択し、対応するモノマーのアニオンを生成する衝突誘起解離（CID）の実験を使用して衝突で活性化し、その後、解離、¯とA _I¯、 図1aに示すそれぞれkおよびkの _Iの速度定数、とされています。二次フラグメンテーションが無視できる場合、CIDフラグメントイオンの存在比は、[A¯] / [A _{iの¯]、iが} k個 / kと速度定数の比の概算値を表している。全く逆activatが存在しないという仮定の下両方の解離チャネル、比率分岐CIDプロダクトイオンのためのイオン障壁はln [A¯] / [A _iの ¯]、直線的気相ペプチドの酸性度（Δ _酸 H）及びそれらに相関する基準酸（Δ _酸 H _i）は 、 図1bに示すように、この式で、Δ _酸 H _平均が基準酸の平均気相酸性度であり、Δ（ΔS）は （基準酸は、互いに構造的に類似している場合に一定であると仮定することができる）エントロピー用語であり、Rは一般気体定数、およびT _effは 、システムの有効な温度である。効果的な温度は、衝突エネルギーを含むいくつかの実験的な変数に依存する経験的なパラメータである。

気相酸性度の値は、熱運動プロットの二組を構築することによって決定される。最初のセットはOBです。LNをプロットしtained（[A¯] / [A _I¯]）Δ酸 H _Iに対して- Δ _酸 H _平均 、 図4aに示すように。線形回帰は、YのX = 1 / RT _EFFとインターセプトの斜面と直線の集合が得られます= – [Δ _酸 H – Δ _酸 H _平均 ] / RT _EFF – Δ（ΔS）/ R。プロットの第二のセットは、 図4bに示すように、対応する斜面（X）に対する第一のセットから得られたインターセプト（Y）をプロットすることによって得られる。 Δ _酸 H _平均とΔ（ΔS）/ Rの切片-線形回帰は、Δ _酸 Hの傾きを持つ新しい行を生成します。 Δ _酸 Hの値は、勾配から得られる、エントロピー用語、Δ（ΔS）は 、から得られるインターセプト。

実験は、エレクトロスプレーイオン化（ESI）イオン源とインターフェーストリプル四重極質量分析計を用いて行われる。質量分析計の概略図を図2に示されている。 CID実験は質量が第1四重極ユニットと結合したプロトンのクラスターアニオンを選択し、それらを約0.5トルの圧力で保持される衝突室に漏れアルゴン原子との衝突を受けるようにすることによって行われる。解離生成イオンは、質量第四重極ユニットを分析する。 CIDスペクトルはすべての可能な二次のフラグメントをカバーするのに十分な幅のm / z範囲を持ついくつかの衝突エネルギーで計上される。 CIDプロダクトイオン強度は、スキャンが選択されたプロダクトイオンに焦点を当てていた選択反応モニタリング（SRM）モードでの機器を設定することによって測定される。 CID実験に対応する4つの異なる衝突エネルギー、で行われるそれぞれ1.0、1.5、2.0、2.5 eVでの重心エネルギー（E _センチ ）。重心エネルギーは式を用いて計算される：E _センチ = E _ラボ 〔m /（M + m）は]、E _実験、実験室フレーム内の衝突エネルギーであり、mはアルゴンの質量であり、Mはプロトン結合型クラスターイオンの質量。

本稿では、モデル化合物として、オリゴペプチドアラモ₃ CysNH _{2（CH 3）}を使用します。 C末端がアミド化されとシステイン残基のチオール基（SH）が酸性のサイトになります。適切な基準酸の選択は、気相酸性度の正常な測定のために重要である。理想的な基準酸は、構造的に類似している（相互に）十分に確立された気相酸性度値を有する有機化合物。基準酸は、ペプチドの酸性度に近い値を有するべきである。ペプチド₃ CHの場合、6はカルボンハロゲン化C酸が基準酸として選択される。 6参照酸は、クロロ酢酸（MCAH）、ブロモ酢酸（MBAH）、ジフルオロ酢酸（DFAH）、ジクロロ酢酸（DCAH）、ジブロモ酢酸（DBAH）、およびトリフルオロ（TFAH）です。そのうちの二つ、DFAHとMBAHは、プロトコルを示すために使用される。