1. Clonare i geni terapeutici nel vettore navetta HDAd Clone del mouse Ngn3 e Btc cDNA nel vettore pLPBL1 plasmide che contiene un onnipresente fattore di allungamento-1 promotore (BOS) e un poli Un segnale. Al termine, verificare vettori di analisi di sequenza e quindi subclonare queste cassette di espressione in pΔ28 navetta HDAd plasmide 6. Digest vettori shuttle HDAd di PMEI per rilasciare la spina dorsale plasmide, purificare DNA con fenolo / cloroformio / alcol isoamilico estrazione seguita da precipitazione con etanolo e ricostituire con acqua di grado trasfezione. 2. Helper-dependent Production vettore adenovirale Vettore di produzione HDAd prevede più passaggi che devono essere seguite attentamente per ottenere risultati ottimali. 2,1 Transfection Due giorni prima della transfezione, seme 116 cellule in 6-7 centimetri piatto raggiungere 70-80% confluenti il giorno della trasfezione. Tre ore prima della transfezione, rimuovere medie e si aggiungono 5 ml di mezzo di crescita fresco [MEM supplementato con 10% FBS e 1% PSG (penicillina, streptomicina e glutammina), Invitrogen]. Transfettare 116 celle con 10 microgrammi di DNA dal punto 1.2), utilizzando il kit di trasfezione dei mammiferi ProFectionR da Promega secondo le istruzioni del produttore. Il giorno successivo, lavare le cellule con 1 ml di mezzo di crescita due volte. Aggiungi virus helper (HV) a 500 particelle vettore (vp) / cellula di 0,1 ml di PBS contenente calcio e magnesio (PBS + +) e di sovrapposizione alle cellule. Agitare delicatamente i piatti per distribuire uniformemente il HV ogni 10 min. Dopo 60 minuti, aggiungere 1,5 ml di mezzo di manutenzione (MEM, 5% FBS, PSG 1%). Aggiungere un altro 1 ml di mezzo di manutenzione il giorno successivo. Osservare le cellule per CPE (Effetto citopatico – le cellule diventano arrotondate e staccato). Superiore al 80% delle cellule dovrebbe mostrare CPE 2 giorni dopo l'infezione. Raccogliere lisato grezzo cellulare (CVL, cellule e medie), undd volume 10% di 40% di saccarosio e conservare a -80 ° C. La CVL è etichettato come passaggio 0 – (CVL-P0). 2,2 Vector amplificazione Congelamento (-80 ° C, 3-5 min) / disgelo (37 ° C, 1-2 min) 3 volte. Overlay 0,5 ml CVL integrato con HV a 200 vp / cella confluenti 116 celle in 6 cm piatto, il piatto e rock delicatamente ogni 5 min. Dopo 30 minuti, aggiungere 1 ml di terreno di mantenimento. Aggiungere 1 ml di manutenzione ordinaria mezzo dopo. 2 giorni più tardi, la maggior parte delle cellule dovrebbe mostrare CPE. Raccogliere il CVL e conservare a -80 ° C (CVL-P1) come descritto per la fase 2.1.8). Ripetere la procedura per 3 volte per ottenere il CVL P2-P4. Estrarre DNA (sangue DNeasy & Tissue Kit, Qiagen) da 0,2 ml di CVL collezionati in P1-P4, e analizzare il vettore di amplificazione qPCR utilizzando primers HV-e-HDAd specifici (Tabella 1). Utilizzare il passaggio in cui HDAd esponenzialmente amplificato rispetto HV (P3 in figura 2) per l'successivamente unt procedura. Co-infettare 90% confluenti 116 celle in piatto 15 cm con 0,5 ml CVL e HV a 200 vp / cella. Rock the piatto delicatamente ogni 5 min. Dopo 30 minuti, aggiungere 10 ml di terreno di mantenimento. Aggiungere 5 ml di terreno di mantenimento dopo 24 ore. Raccogliere le cellule per centrifugazione a 1500 xg per 5 min esattamente 48 ore dopo l'infezione. Risospendere le cellule in 1 ml di PBS + + contenente 4% di saccarosio (P5) e congelare a -80 ° C. 2,3 su larga scala di produzione HDAd Per preparare 116 cellule in coltura per infezione sospensione cellulare, trasferire cellule confluenti 116 a 8 x 15-cm piatto in 3 L filatore beuta e aggiungere crescita mezzo di sospensione (Joklik modified MEM supplementato con 5% FBS, 0,1 mg / ml di igromicina e 1% PSG) a finale 1 L, e incubare in un incubatore con CO 2 filatura a 60 rpm 8. Aggiungere 0,5 L di mezzo fresco ogni giorno per 2 giorni (totale 2 L). Contare le cellule il terzo giorno. Le cellule sono pronte per l'uso, se raggiungere to numero di cellule totale di 1×10 9. Gelo / disgelo P5 3 volte. Raccogliere cellule dal matraccio 3 L filatore mediante centrifugazione a 1000 xg per 5 min. Salva 100 ml di surnatante di ri-sospendere le cellule. Trasferire le cellule a un pallone da 250 ml filatore. Aggiungere P5 ed a 200 HV vp / cella cellule e incubare per 1 ora a 37 ° C a 60 rpm. Cellule di trasferimento e di media a pallone 3 L filatore, aggiungere 2 sospensione mezzo L crescita. Trasferire 1 ml di sospensione cellulare per un pozzo in un 12-pozzetti per osservare le cellule per CPE. Incubare le cellule in filatore pallone per 2 giorni in un incubatore CO 2 a 60 rpm. Raccogliere le cellule per centrifugazione e risospendere con 15 ml di 100 mM Tris-HCl (pH 8,0) e conservare a -80 ° C (P6) fino purificazione. 2,4 Vector depurazione Aggiungere 1,0 ml di sodio desossicolato 5% a P6. Mescolare delicatamente e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere 400 ml di 2 M MgCl2, 300 μl di RNasi A (10 mg / ml) e 300 ml di DNasi I (10 mg / ml) e incubare a 37 ° C per 1 ora. Centrifugare a 6000 xg per 10 min a temperatura ambiente per raccogliere il supernatante. Sterilizzare NVT 65 tubi ultracentrifuga (Beckman) alla luce UV per 1 ora in cappuccio di coltura tissutale. Aggiungere 2,8 ml di soluzione a bassa densità CsCl (1,25 g / ml), 2,8 ml di sottofondo soluzione ad alta densità densità CsCl (1.41g/ml) e quindi overlay 5-6 ml di surnatante per riempire il tubo al collo. Utilizzare 100 mM Tris-HCl (pH8.0) per riempire il tubo se necessario. Centrifugare a 10 ° C per 30 minuti a 50.000 giri al minuto a 10 ° C con Beckman LE-80K con NVT-65 rotore. Pulire la zona con etanolo al 70% per puntura, e raccogliere la banda inferiore opalescente con una siringa da 3 ml equipaggiato con 22-G dell'ago puntura laterale (Figura 3a). A volte una band di supporto molto debole può essere visto sotto la banda di vettore più importante. Cercate di ottenere il maggior numero di secoloe banda vettore come possibile, senza la band di supporto. È accettabile in questa fase, anche se alcuni della banda helper viene aspirato, come verrà separate alla successiva centrifugazione overnight che segue. Posizionare le bande raccolti in un nuovi tubi ultracentrifuga sterilizzati. Riempire i tubi al collo sovrapponendo 1,35 g / ml soluzione densità CsCl. Centrifugare a 10 ° C a 50.000 giri al minuto durante la notte. Raccogliere la banda opalescente (Figura 3b). Trasferire la band in una cassetta di dialisi (Slide-a-lizzatore, 10.000 MWCO, Thermo-scientifica). Dializza contro 3 L di 10 mM autoclavato Tis-HCl, pH 7,2 contenente 2 mM MgCl 2 e il 4% di saccarosio a 4 ° C per una notte. Rimuovere il vettore HDAd dalla cassetta dialisi. Aliquotare 20 microlitri per titolo fisica e 50 pl per la caratterizzazione del DNA. (Nota: per Ngn3 vettore, ripetere "P6" tre volte per ottenere il vettore sufficiente, poiché il rendimento delle HDAd-Ngn3 è povera rispetto a HDAd-Btc o HDAd-vuoto.) 2,5 Caratterizzazione dei vettori HDAd Determinare il titolo fisico (vp / ml) con densità ottica (OD). Aggiungere 20 microlitri vettore o 20 microlitri tampone di dialisi a 380 microlitri tampone TE contenente 0,1% SDS e incubare a 56 ° C per 20 min. Misurare la densità ottica a 260 nm. Il titolo fisico = OD260 x 1.1 x 10 12 x 20 (vp / ml). Analizzare contaminazione HV da qPCR. Utilizzare aliquota 50μl per estrarre il DNA utilizzando tessuti DNeasy / DNA Kit di estrazione del sangue (Qiagen). Diluire il DNA 1000 volte e prendere 5 microlitri per l'analisi qPCR utilizzando helper e vettoriali primer specifici (Tabella 1). La contaminazione helper dovrebbe essere inferiore a 1%, come mostrato in Figura 4A. Utilizzare Southern blot per analizzare la struttura vettoriale. Effettuare analisi Southern blot con una sonda 10 per la ripetizione terminale invertita (ITR). Il risultato rappresentativo è mostrato nella Figura 4B. Determinare in efficacia in vitro. Infettare notonumero di 116 cellule in una piastra a 12 pozzetti con il vettore HDAd a 1000 vp / cella in quadruplice copia. Raccogliere le cellule dopo 48 ore ed estrarre l'RNA per determinare l'espressione di mRNA e Ngn3 Btc da RT-PCR (Tabella 1). Risultati rappresentativi sono mostrati in Figura 5. 3. Il trattamento di topi diabetici da HDAd Ngn3-e-Btc 3,1 induzione del diabete nei topi e l'iniezione di vettori HDAd Preparazione di STZ: Preparare tampone citrato 0,1 M, e aggiustare il pH a 4,3-4,5. Filtrare questo attraverso un filtro a siringa da 0,22 mm. L'utilizzo di acqua sterile diluire questa a 0,01 M Na citrato pH 4,2-4,5. Sciogliere quantità appropriata di STZ (Sigma) in questa soluzione per ottenere una concentrazione finale di 12,5 mg / ml. A questa concentrazione non vi è nessuna precipitazione. Conservare tale soluzione STZ a 4 ° C fino utilizzata. Portare la temperatura della soluzione a temperatura ambiente iniettare immediatamente prima dell'iniezione. La soluzione shoul STZd essere preparato fresco ogni giorno e iniettata entro 5-10 minuti di dissolversi. Iniettare la soluzione STZ per via intraperitoneale (10 microlitri / gm per ottenere una dose di 125 mg / g di peso corporeo), la sera tra le ore 5-7 (prima che le luci si spengono nella struttura del mouse e topi avviare l'alimentazione attiva), per due giorni consecutivi 9. 3,2 di monitoraggio topi glucosio e l'iniezione di vettori HDAd. Topi veloci per 6 ore e il peso corporeo e la misura della glicemia settimanale fino topi hanno iperglicemia (≥ 250mg/dl). Utilizzare un glucometro One Touch per sangue raccolto da snip coda. Una volta che la glicemia è ≥ 250 mg / dl, ricontrollare la glicemia di nuovo in 48 ore dopo un ora sei veloce per garantire iperglicemia persistente e di glucosio nel sangue è all'interno dell'intervallo di riferimento per il trattamento: 250-500 mg / dl. Trattare topi con iperglicemia persistente da parte di una singola iniezione endovenosa di vettori HDAd via vena della coda. La dose totale vettore è 6×10 11 vpper tutti i gruppi di trattamento (in 0,25 ml): 5×10 11 vp Ngn3 1 x10 11 vp Btc per il gruppo combinazione; 5×10 11 vp Ngn3 + 1×10 11 vp per Ngn3 gruppo e 1×10 11 vp Btc + 5×10 11 vp vettore vuoto per il gruppo e Btc 6×10 11 vp vettore vuoto per il gruppo di controllo. Coda vena iniezione. Mettere i topi in Tailveiner di contenimento (TV-150, Braintree Scientific Inc.), e utilizzare acqua calda per dilatare le vene coda, pulire la coda con il 70% di alcol. Tenere la coda sotto il sito di iniezione tra il pollice e l'indice della mano, utilizzare un altro mano per iniezione. Prima dell'iniezione assicurarsi che non vi siano bolle nella siringa (con 30 1/2 G e aghi siringa da 1 ml). Inserire l'ago e iniettare lentamente il vettore. Se l'ago è in vena, un lampo di sangue può essere visto nel mozzo dell'ago e inoltre non c'è resistenza durante l'iniezione. Dopo aver rimosso l'ago, tenere premuto il sito di iniezione con una garza per arrestare l'emorragia prima di tornare topi to gabbia. Se l'ago non è in vena c'è resistenza significativa ad iniezione e un po sottocutanea pomfo deriva. A questo punto togliere l'ago e riprovare in un sito diverso. 3.3 Analisi degli effetti di HDAd-Ngn3 + HDAd-Btc trattamento. Monitor 6 ore glicemia a digiuno e di peso corporeo alla settimana dopo il trattamento vettore. Raccogliere il sangue dalla vena safena o vena della coda della gamba ogni 2 settimane a dosaggio dell'insulina (insulina mouse kit ELISA, Mercodia) e degli enzimi epatici (AST e ALT reagenti Infinity, Thermo Scientific) utilizzando kit commerciali. Posizionare il mouse su una non livellata tubo da 50 ml Falcon con fori praticati alla fine chiusa. La testa del mouse è all'estremità chiusa del tubo e gambe e coda sul lato aperto del tubo. Per raccogliere il sangue dalla gamba sinistra, estendere la gamba sinistra esterna del tubo e delicatamente pizzicare la pelle della coscia tra il pollice e l'indice di immobilizzare la gamba. Utilizzareun rasoio per rimuovere i capelli dal stinco / zona inferiore della gamba, per esporre la vena safena, che è presente sul lato laterale della gamba. Pulire la pelle rasata con il 70% di alcool e lasciare asciugare. Pungere la vena safena con un ago da 25 gauge, Raccogliere il sangue con tubo Microvette CB300 (Sarstedt) e mettere i tubi sul ghiaccio. Premere il sito di puntura con una garza per arrestare l'emorragia prima di restituire i topi per le gabbie. Centrifugare le provette a 3000 xg per 5 minuti, prendere il surnatante e conservare a -20 ° C per ulteriori analisi. 3,4 Eseguire test di tolleranza al glucosio (GTT) a 6 settimane dopo il trattamento. Disciolto D-glucosio (Sigma) in acqua distillata per ottenere il 15% di glucosio (15 g / 100 ml) e filtro sterile il glucosio. Topi veloci per 6 ore. Utilizzare pad calda per riscaldare i topi e raccogliere il sangue (0 punto nel tempo min). Iniettare 1,5 g / kg di D-Glucosio ip (10 microlitri / g del 15% glucosio). Collezionare sangue a 15, 30, 60, 120 min. Misurare il glucosio e insulina in tutti questi campioni. 3.5 Analisi del tessuto per valutare l'espressione dei vettori e valutare l'induzione di isolotto neogenesi. In tutti questi passaggi i controlli necessari per interpretare affidabile i risultati includono: (1) il vettore vuoto trattato topi diabetici (2) non diabetici topi e (3) non diabetico pancreas che serve come controllo positivo per l'espressione dell'isolotto ormoni e fattori di trascrizione specifici. Harvest fegato e pancreas a 3 e 6 settimane dopo il trattamento. Dividere in due parti, la prima per il congelamento in azoto liquido a scatto e stoccaggio a -80 ° C per l'estrazione di RNA e proteine, e il secondo per fissare con formalina al 10% durante la notte per analisi immunoistochimica. RNA estratto da un protocollo standard e analizzare l'espressione di specifici ormoni insulari e fattori trascrizionali, insieme Ngn3 e Btc a confermam vettore di espressione, nel fegato da RT-PCR utilizzando primer specifici 9, 10. Estrarre l'insulina e C-peptide dal fegato mediante acido-etanolo metodo di estrazione e quantificare da un commerciale kit ELISA (test di insulina ultra sensibile, Mercodia, C-peptide ELISA kit, Wako). Eseguire immunostaining per insulari specifici ormoni (insulina, glucagone, PP, SST) con isole specifici fattori di trascrizione in paraffina sezioni 9, 10. L'espressione di Ngn3 e BTC possono essere confermati mediante immunocolorazione. 4. Risultati rappresentativi Abbiamo clonato Ngn3 e Btc cDNA in vettori pΔ28 guidati dal promotore eIF2a onnipresente (BOS) e ha generato HDAd-Ngn3 e HDAd-Btc. Come mostrato in figura 2, relativa contaminazione HV diminuito significativamente (implicando amplificazione vettore più e meno amplificazione helper) al passaggio 3. Pertanto, abbiamo utilizzato P3 per vettore di produzione successiva. Dopo la primaCsCl gradiente discontinuo e ultracentrifugazione, abbiamo raccolto la banda minima vettore e quindi raccolto la banda corrispondente al vettore opalescente HDAd nel ultracentrifugazione secondo (Figura 3). Il vettore purificato HDAd aveva meno dell'1% di contaminazione HV (Figura 4A) da qPCR e non aveva contaminazione helper visibile sul Southern blot (Figura 4B), indicando qualità sufficiente per infusione vettoriale in topi. Ulteriori analisi inclusa l'espressione del transgene da infezione di cellule 116. I livelli di espressione di mRNA di Ngn3 e Btc erano più alti nelle cellule infette vettore con oltre 10.000 volte rispetto a quelle in cellule non infette (Figura 5). HDAd-Ngn3 e-Btc stati poi somministrati a topi diabetici STZ-indotta tramite iniezione nella vena della coda con vettore vuoto iniettata e HDAd-Btc topi diabetici iniettati servono come controllo negativo. Iperglicemia è stato invertito e glucosio secrezione di insulina stimolataè stata restaurata nei topi trattati con entrambi HDAd-Ngn3 e HDAd-Btc, ma non nei topi trattati con il vettore singolo gene o vettore di controllo vuota (Figura 6). Il HDAd-Ngn3-Btc trattamento indotta isolotto neogenesi e questo è stato quantificato testando contenuto totale di insulina e C-peptide (Figura 6E) con i non-diabetici, topi diabetici trattati vettore vuoto che servono come controlli. La presenza di c-peptide e insulina in rapporti equimolari conferma che l'insulina viene rilevato nel fegato è infatti viene sintetizzata nel fegato. RT-qPCR ha confermato che il fegato dei topi trattati HDAd-Ngn3-Btc espresso tutte le isole specifici ormoni e fattori di trascrizione 9. Immunoistochimica mostrava cellule positive insulina nel fegato di topi trattati con HDAd-Ngn3 e HDAd-Btc, ma non le cellule insulina positivi sono stati osservati nei topi trattati con il vettore di controllo (Figura 7). Abbiamo anche confermato che non vi erano isole residue nel pancreas del Ngn3-Btc treated topi rispetto ai numerosi isolotti non diabetici pancreas. Vector (Ngn3 e Btc), insieme con il fattore di trascrizione specifico lineage isolotto (PDX-1 e Nkx6.1) espressione è stata valutata anche mediante immunocolorazione del fegato (Figura 7). Figura 1. Diagramma di flusso della terapia genica su topi diabetici con helper-dipendenti del sistema virus. Primo, Ngn3 e BTC, in una cassetta guidata da un promotore ubiquitario BOS, vengono clonati in HDAd navetta (pΔ28) vettori. HDAd è prodotto da diversi passaggi tra trasfezione, passaggi seriali di amplificazione, e un'infezione larga scala seguita da purificazione vettore. Dopo caratterizzare la qualità, HDAds vengono iniettati per via endovenosa in topi diabetici STZ-indotta tramite vena della coda. Gli effetti del trattamento sono valutati da glucosio di misura, il peso corporeo, GTT e da analisi di espressione genicanel fegato. Figura 2. Determinazione amplificazione vettore HDAd. DNA viene estratto dal passaggio P0 a P4 utilizzando kit di estrazione del DNA (Qiagen). DNA viene diluito DNA di 1.000 volte e 5μl viene utilizzata per real time PCR (qPCR). Primer di supporto e vettore-specifici sono utilizzati. Le curve standard sono generati da diluizioni seriali (10 -5 a 1 ng / ml) di HDAd navetta vettore plasmidico e HV plasmidici (pannelli superiori). Utilizzando le curve standard ei valori di Ct per il numero di copie di vettore e virus helper viene calcolato e il rapporto di HDAd / HV è riportato come percentuale del virus totale (helper + HDAd). Quindi, l'amplificazione vettore relativo è calcolato come segue: [numero di copie di vettore / (vettore numero + copia del virus helper)]. Nell'esempio illustrato (pannello inferiore) amplificazione vettore HDAd stabilizzato sui P4, mentre la relativa HDAd / HV sta aumentando a P3. Pertanto, P3 è selezionata per la fase successiva. Figura 3. Rappresentativi bande vettore HDAd discontinuo dopo ultracentrifugazione densità CsCl. Vector HDAd viene purificato da una cultura filatore 3L sopra sequenziale gradiente di densità CsCl. (A) Dopo ultracentrifugazione prima gradiente di densità, una singola banda vettore opalescente è visibile (freccia) sotto detriti cellulari opaco (CD). La band opalescente (freccia) sono raccolte per centrifugazione secondo gradiente di densità. (B) Dopo la seconda ultracentrifugazione gradiente di densità, la band opalescente (freccia) viene raccolto per la dialisi. Figura 4. Analisi di contaminazione da virus helper. DNA viene estratto da 50μl virus purificato e contaminazione helper è unssessed come in Figura 2. La figura mostra la contaminazione helper di HDAd-Ngn3 e HDAd-Btc è inferiore all'1%. Figura 5. Blot analisi della struttura del vettore HDAd. Southern viene eseguita come descritto in precedenza (Oka K, et al.). Corsia 1: DNA da virus helper, Corsia 2: DNA da P3; Corsia 3: DNA da P4, Corsia 4: vectopr purificato. Aperte le frecce indicano le bande di supporto virus derivati e le frecce piene indicano le bande ITR derivati dal vettore HDAd. Figura 6. Livello di espressione di Ngn3 o Btc in 116 cellule infettate con il vettore HDAd-Ngn3 o HDAd-Btc. 116 celle in un 12 pozzetti sono infettati con il vettore HDAd-Ngn3 o HDAd-Btc o vuoto a 1000 vp / cella per 2 giorni. CeLLS sono stati raccolti e RNA totale è estratto usando il reagente Trizol. RT-PCR viene eseguita utilizzando Ngn3-o BTC primer specifici. Il Ngn3 parente o espressione di mRNA Btc è aumentato di oltre 10.000 volte nelle cellule infette con HDAd-Ngn3 o HDAd-Btc. La figura è ristampato da Dev.Cell mar 2009, 16 (3): 358-73; Yechoor et. al., con il permesso di Elsevier. Figura 7. Trasferimento genico di HDAd-Ngn3 e HDAd-Btc in STZ indotto topi diabetici porta ad inversione di diabete e induzione di isolotto neogenesi nel fegato. (A) al plasma glucosio e (B) di peso corporeo di STZ indotto topi diabetici trattati con HDAd-Ngn3 e HDAd-Btc. (C) al plasma del glucosio e di insulina nel corso di un IP-GTT a 6 settimane dopo il trattamento. (D) colorazione rappresentativa insulina nel fegato 12 settimane dopo il trattamento. * P <0,05 (vs gruppo vettore vuoto). La figura è ristampato da Dev. Cell 2009, 16 (3): 358-73; Yechoor et al, con il permesso di Elsevier.. nome primer forward primer reverse aiutante GACCATCAATCTTGACGACC ATGTCGCTTTCCAGAACCC vettore TTGGGCGTAACCGAGTAAG ACTTCCTACCCATAAGCTCC Ngn3 AAGAGCGAGTTGGCACTCAG TCTGAGTCAGTGCCCAGATG Btc GCACAGGTACCACCCCTAGA TGAACACCACCATGACCACT Tabella 1. Sequenze primer.
