Ensaio de placas para Norovirus Murine

O método de ensaio de placa para MNV-1 aqui apresentado é uma forma de quantificar partículas infecciosas MNV. Seguindo os passos de ensaio ilustrado na Figura 3, pode-se obter títulos virais reprodutíveis. O limite de detecção do ensaio depende da diluição de partida utilizado. Ao iniciar com uma diluição de 1:10 da amostra, tal como descrito acima, o limite de detecção do ensaio de placa é de 10 pfu (isto é, uma placa visível na diluição 10 ^-1). Uma vez que cada placa representa um único vírus, o ensaio de placa pode também ser utilizado para purificar as populações clonais de MNV escolhendo placas isoladas e propagando-los conforme descrito anteriormente ^1. Além disso, a purificação de placas também pode ser usado para separar uma população de vírus individuais a partir de populações mistas de vírus. Uma limitação do uso de um ensaio de placas para a detecção de infecção MNV é que nem todas as estirpes mnv formar placas ^4. No entanto, pode ser possível ultrapassar o inabilidade de algumas estirpes de MNV, isolados a partir de animais, para formar placas em série passaging destes vírus em cultura de tecido ^7. Uma alternativa para o ensaio de placa é o de medir partículas infecciosas por meio da técnica de TCID ₅₀ ^{3, 4.} Este ensaio quantifica a quantidade de vírus necessária para produzir CPE em 50% das células de cultura de tecidos inoculadas seguintes diluições de ponto de extremidade e leva 1 semana para completar para MNV ^4. Além de ser mais lento do que um ensaio de placa, o ensaio de TCID ₅₀ também não é tão sensível (limite de detecção = 200 TCID ₅₀ / ml), devido à toxicidade de amostras de tecido de células RAW 264.7 ^4.

Embora passos críticos no âmbito do protocolo foram descritos ao longo do protocolo, a seção seguinte apresenta um resumo para facilitar a resolução de problemas. Os passos mais importantes do protocolo é o de assegurar que as células RAW 264.7 permanecem viáveis ​​ao longo do ensaio para suportar a replicação do vírus. Isto podeser monitorizado em cada fase do ensaio por meio de microscopia de luz. A viabilidade celular é assegurada de duas maneiras. Primeiro, deve ser tomado cuidado para não deixar secar as células durante o manuseio de placas. Assim, as placas são inoculadas um de cada vez, agitou durante o período de infecção, e devem permanecer fechadas quando não estão a ser tratadas. Em segundo lugar, as soluções adicionado em células devem ser equilibradas para ~ 37 ° C. Além disso, é essencial para a saúde geral das células RAW 264.7 de mantê-las em meio contendo soro de endotoxina baixa (<10 EU / ml), o que limita a activação de células. Além disso, observou-se uma maior taxa de falha do teste de placa quando são usadas células de passagem 30 ou superior. Embora isso provavelmente irá variar de laboratório para laboratório, é importante incluir um controlo positivo (por exemplo, uma amostra com um título conhecido viral) para assegurar títulos reprodutíveis, especialmente quando se utiliza mais elevadas de passagem células RAW 264.7. Para limitar a utilização de células mais elevadas de passagem, é aconselhável congelar frascos de Passa precocecélulas ge após o recebimento de células RAW 264.7 e iniciar uma nova cultura dos frascos congelados freqüência. Começando por cima, com culturas de células de passagem baixa também será útil quando as células apresentam características alteradas, tais como a incapacidade de aderir, as alterações na morfologia celular (por exemplo, de volta para espigado e espalhar-se), ou quando a contaminação por micoplasma foi detectado. Outro ponto importante a prestar atenção é para garantir que ponteiras são trocadas entre as amostras e durante diluições. Isto irá assegurar precisas diluições seriadas e evitar a contaminação cruzada entre as amostras. O primeiro passo no protocolo em que a ponta da pipeta mesmo pode ser utilizado de novo, quando é diluições em série de uma mesma amostra são adicionados aos poços. Nesse caso, a pessoa deve começar a partir do inóculo mais diluído para o mínimo, e vigorosamente pipetar cima e para baixo ao elaborar uma nova diluição.

O protocolo de ensaio de placa pode ser alterada a várias modificações. Uma modificação que pode ser feita quando taqui não são suficientes para a inoculação de células de poços em duplicado é apenas para inocular um único poço de cada diluição. No entanto, uma vez que o volume de inoculo é de 0,5 ml, o número de placas, em seguida, tem de ser multiplicado por um factor de 2 para normalizar a pfu / ml. O ensaio de placa pode também ser adaptado para utilização com qualquer linha celular aderente outro que é capaz de suportar a replicação de MNV, e esta tem sido descrita para a linha microglial murino BV-2 de ⁸ células. Outras modificações que podem ser aplicadas são as adaptações que foram descritas para os protocolos de ensaio de placas desenvolvidas em outros vírus. Em caso de MNV, as seguintes modificações já foram implementadas com sucesso, a utilização de celulose de metilo em vez de agarose Sea Plaque ^9, e coloração das células com violeta de cristal ou azul de metileno em vez de vermelho neutro ^{10, 11.}

No geral, este protocolo pode ser facilmente adaptado, conforme necessário para quantificar outros formadoras de placas de vírus ou utilizados para other vírus que causam infecções líticas em RAW 264,7 células, tornando-se uma ferramenta útil para quantificar partículas virais infecciosas em geral.