マウスノロウイルスのプラークアッセイ
Summary
ここでは、効率的に細胞培養で複製のみノロウイルスですマウスノロウイルス（MNV）の感染性粒子を定量化する方法を説明します。プラークアッセイは、マウスのマクロファージのためにMNVの向性を活用し、MNVを含む生物学的または環境試料での使用に適合させることができる。
Abstract
マウスノロウイルス（MNV）が効率的に組織培養1,2で育つノロウイルス属の唯一のメンバーです。細胞溶解および細胞変性効果（CPE）をマウス樹状細胞やマクロファージ1のMNV-1感染の間に観察される。 MNV-1のこのプロパティは、プラークアッセイ1を実行することによって、与えられた試料中の感染性粒子の数を定量化するために使用することができます。プラークアッセイは、細胞を溶解し、プラークと呼ばれる3コンフルエントな細胞単層に穴を形成するためにMNV-1の能力に依存しています。
複数の手法は、組織培養、採取された組織、臨床、環境試料中のウイルス感染を検出するために使用ではなく、すべてのメジャー感染性粒子の数（ 例えば定量RT-PCR）。することができます感染性ウイルス粒子を定量化する1つの方法は、以下に詳細に説明するプラークアッセイ3を実行することです。 MNVのプラークアッセイのバリエーションは、蛍光であるMNVの抗原が細胞単層4で免疫染色され自己消費フォーカスアッセイ。ウイルス抗原の発現はプラーク形成に先行するので、このアッセイは、高速化することができます。また、プラークを形成することができませんウイルスを滴定するのに便利です。しかし、蛍光フォーカスアッセイは、そのような抗体およびフォーカス形成単位をカウントするための顕微鏡などのプラークアッセイのものを超えて追加のリソースが必要となります。 MNVの感染も50％組織培養感染量（TCID 50）3を決定することにより定量することができる。このアッセイは、エンドポイントの滴5によって接種組織培養細胞の50％のCPEを生成するために必要なウイルス量を測定します。しかし、検出限界は、プラークアッセイ4に比べて高くなっています。
この記事では、我々は効果的に、生物学的または環境試料1、4、6に存在する感染MNVの粒子の数を決定するために用いることができるプラークアッセイプロトコルを記述します。この方法は、BAです許容細胞（RAW 264.7マウスマクロファージ細胞）の単層を接種するために使用されているMNVの含有試料の10倍希釈系列の作成に関するSED。ウイルスは、特定の期間のために細胞単層に付着させた後、アガロースおよび細胞培養培地の混合物を用いて細胞を覆う前に吸引される。遠くにある細胞に広がりを制限しながら、寒天は、隣接する細胞にウイルス子孫の広がりを可能にします。その結果、感染した細胞を溶解し、プラークとして知られている単層の穴を形成している。ウイルスの十分普及すると、プラークはニュートラルレッド、メチレンブルー、またはクリスタルバイオレットのような染料を用いた細胞の可視次の染色になります。低希釈で、各プラークは隣接セルに広がる1感染性ウイルス粒子とその子孫に由来します。このように、斑の数をカウントすると、1つは、無希釈サンプル3に存在するプラーク形成単位（PFU）を計算することができます。
Protocol
Discussion
ここに提示さMNV-1のためのプラークアッセイ法は、感染MNVの粒子を定量化する方法である。 図3に示されているアッセイの手順に従うことによって、1は、再現性のウイルス力価を得ることができます。アッセイの検出限界は使用する原料希釈に依存します。上記のようなサンプルの1:10希釈で始まる場合には、プラークアッセイの検出限界は10 PFU（ すなわち、10 -1希釈で見える1プラーク）です。各プラークは、単一のウイルスを表すので、プラークアッセイはまた、単離されたプラークをピッキングし、それらを先に説明した1伝播することによってMNVのクローン集団を精製するために使用することができます。また、プラーク精製は、混合ウイルス集団から個々のウイルス集団を分離するために使用することができます。 MNVの感染を検出するためのプラークアッセイを使用しての制限ではなく、すべてのMNVの株がプラーク4を形成することである。しかし、それはinabiliを克服することが可能かもしれない直列組織培養7に、これらのウイルスを継代することによりプラークを形成するために、動物から単離されたいくつかのMNVの株のTY、。プラークアッセイの代替は、TCID 50のテクニック3、4を介して感染性粒子を測定することです。このアッセイは、エンドポイントの希釈後に接種し、組織培養細胞の50％のCPEを生成するために必要なウイルス量を定量化し、MNVの4のために完了するには、1週間かかります。プラークアッセイよりも遅いことに加えて、TCID 50アッセイはまた、小文字は区別されません（検出限界= 200 TCID 50 / ml）のRAW264.7細胞は4〜組織サンプルの毒性のために。
プロトコルの中の重要なステップは、プロトコル全体に記載されているが、次のセクションでは、トラブルシューティングを容易にするための概要を提供します。プロトコルの中で最も重要なステップは、RAW264.7細胞は、ウイルスの複製をサポートするためのアッセイを通じて生存し続けることを確実にすることです。これは、することができます光学顕微鏡を介して、アッセイの各段階で監視される。細胞生存率は2つの方法で確保されている。まず、注意がプレートを取り扱いながら、細胞が乾燥させないように注意するべきです。したがって、プレートは、一度に1つを接種し感染期間中に揺れ、それらが処理されていないときは閉じたままにしてくださいされています。細胞上に追加された2番目の、解決策は〜37℃に平衡化する必要がありますさらに、それは細胞の活性化を制限し、低エンドトキシン血清（<10 EU / ml）を含む培地中で、それらを維持するために、RAW264.7細胞の全体的な健康のために不可欠です。通路30以上から細胞を用いたときに加えて、我々はプラークアッセイの高い故障率を観察している。これはおそらくラボからラボごとに異なりますが、それはより高い通路RAW264.7細胞を使用する場合は特に、再現性の力価を確実にするために（ 例えば、既知のウイルス力価を有するサンプル）をポジティブコントロールを含めることが重要です。高継代細胞の使用を制限するためには、早期のPASSAのバイアルを凍結することをお勧めしますGEは、RAW264.7細胞の受領細胞と頻繁に凍結バイアルから新しい文化を開始します。細胞は、付着する障害、細胞形態の変化（ひょろっとへのラウンドからなどと広がる）で使用する場合、またはマイコプラズマ汚染が検出されたとして、変更された特性を示すときに低継細胞培養でやり直すことも参考になります。に注意を払うためのもう一つの重要なポイントは、ピペットの先端がサンプル間及び希釈液中に変更されることを保証することである。これは、正確な希釈を確保し、サンプル間のクロスコンタミネーションを防止します。同じピペットチップを再び使用できるプロトコルの1つのステップは、同じサンプルの連続希釈液をウェルに添加されている場合があります。その場合、1が最も希釈接種から少なくともに起動し、新しい希釈を描画するときに激しくピペッティングしてください。
プラークアッセイプロトコルは、いくつかの修正に修正可能です。トン行うことができます一つの修正ここで二重に井戸を接種するための十分な細胞がないそれぞれの希釈のためにのみ単一ウェルに接種することです。接種量は0.5ミリリットルなのでしかし、プラークの数がPFU / mlになるように正規化するために2の係数を乗じなければならない。プラークアッセイはまた、MNVのレプリケーションをサポートすることができる任意の他の付着性の細胞株での使用に適合させることができ、これはマウスミクログリアBV-2細胞株8に記載されています。実装することができる他の修飾には、他のウイルスのために開発プラークアッセイプロトコルで説明されている適応されています。 MNVの場合には、以下の修正がすでに正常に実装されているのではなく海のプラークのメチルセルロースの使用アガロース9、代わりにニュートラルレッド10、11のクリスタルバイオレットまたはメチレンブルーを用いた細胞の染色を。
全体的に、このプロトコルは、簡単に他のプラーク形成ウイルスを定量化するために、必要に応じて適応またはOTHに使用することができますそれは一般的に感染性ウイルス粒子を定量化するための便利なツールとなって、RAW264.7細胞における溶解感染を引き起こす小胞体ウイルス。
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、批判的なコメントと提案についてWobus研究室のメンバーに感謝。 CEWの実験室での作業は、ミシガン大学、バイオ防衛のための優秀NIH / NIAIDの地域センターと新興感染症研究所（RCE）、プログラム、地域V "グレートからキャリア開発助成金から立ち上げ資金によって賄われていた湖 'RCE（NIH賞1-U54-AI-057153）およびNIH R01 AI080611。 MBG-H。ミシガン大学実験免疫学研究所（NIH T32 A1007413-16）病原微生物学における分子機構（NIH T32 A1007528）訓練助成金によって賄われていた。 JBCはブラジル、ブラジリア、CoordenaçãoデAperfeiçoamentoデPessoalデNívelスーペリア（CAPES）によって賄われていた。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| DMEM/ High glucose | Hyclone | SH30243.02 |
| 2x MEM | Gibco | 11935 |
| 100x Penicillin and streptomycin | Hyclone | SV30010 |
| 10 mM Non-essential amino acids | Hyclone | SH30238.01 |
| 1M HEPES | Hyclone | SH30237.01 |
| 200 mM (100x) L-glutamine | Hyclone | SH30034.01 |
| Fetal Bovine Serum | Gibco, Hyclone | 10437, SH30070.02 |
| Sea Plaque Agarose | Lonza | 50100 |
| Neutral Red 0.33% | Sigma | N2889 |
| 1x PBS | Gibco | 10010 |
| 1.0 mm Zirconia/Silica beads | BioSpec Products | 11079110z |
| Model 35 Speed Rocker | Labnet | S2035 |
| Magna Lyser Instrument | Roche | 03358968001 |
| Raw 264.7 cell line | ATCC | TIB-71 |
| Tissue culture incubator | Sanyo | MCO-18AIC |
Referencias
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