Essai de plaque pour le norovirus murin

La méthode de dosage de la plaque de MNV-1 présenté ici est un moyen de quantifier les particules infectieuses MNV. En suivant les étapes de l'analyse illustrés à la figure 3, on peut obtenir des titres viraux reproductibles. La limite de détection du dosage dépend de la dilution de départ utilisé. Lors du démarrage d'une dilution 1:10 de l'échantillon tel que décrit ci-dessus, la limite de détection du test est la plaque 10 pfu (soit 1 plaque visible à la dilution à 10 ^-1). Étant donné que chaque plaque représente un seul virus, le dosage de la plaque peut également être utilisé pour purifier des populations clonales de MNV en choisissant plaques isolées et leur multiplication comme décrit précédemment ^1. En outre, purifications sur plaque peut également être utilisé pour séparer une population de virus individuel de populations virales mixtes. Une limitation de l'utilisation d'une plaque d'essai pour la détection de l'infection MNV est que toutes les souches MNV former des plaques ^4. Toutefois, il peut être possible de surmonter la inabilité de certaines souches MNV, isolés chez les animaux, pour former des plaques en série passages de ces virus dans ⁷ la culture de tissus. Une alternative à l'essai de plaque est de mesurer les particules infectieuses par la technique DICT ₅₀ ^{3, 4.} Ce test quantifie la quantité de virus nécessaire pour produire CPE dans 50% des cellules de culture tissulaire inoculés après dilutions de point final et prend 1 semaine à remplir pour MNV ^4. En plus d'être plus lent qu'un essai de plaque, le test TCID ₅₀ n'est pas aussi sensible (limite de détection = 200 DICT ₅₀ / ml) en raison de la toxicité des échantillons de tissus pour des cellules RAW 264.7 ^4.

Bien que les étapes critiques dans le protocole ont été décrites dans le protocole, la section suivante fournit un résumé pour faciliter le dépannage. L'étape la plus critique dans le protocole est de faire en sorte que les cellules RAW 264.7 rester viable tout au long de l'essai à charge la réplication du virus. Cela peutêtre contrôlés à chaque étape de l'analyse par microscopie optique. La viabilité cellulaire est assurée de deux façons. Tout d'abord, il faut prendre soin de ne pas laisser sécher les cellules lors de la manipulation des plaques. Ainsi, les plaques sont inoculées une à la fois, bercé pendant la période d'infection, et doit rester fermé quand ils ne sont pas traitées. Deuxièmement, les solutions ajouté sur les cellules doivent être équilibrés à ~ 37 ° C En outre, il est vital pour la santé globale des cellules RAW 264.7 de les maintenir dans un milieu contenant une endotoxine sérique basse (<10 EU / ml), ce qui limite l'activation des cellules. En outre, nous avons observé un taux d'échec plus élevé de l'essai de plaque lors de l'utilisation des cellules de passage 30 ou supérieur. Bien que cela va probablement varier d'un laboratoire à l'autre, il est important d'inclure un contrôle positif (par exemple, un échantillon avec un titre connu virale) afin d'assurer la reproductibilité des titres, en particulier lors de l'utilisation plus élevés passage des cellules RAW 264.7. Pour limiter l'utilisation de cellules de passage plus élevées, il est conseillé de congeler les flacons de début passacellules ge à la réception de cellules RAW 264.7 et commencer une nouvelle culture des flacons congelés fréquemment. Starting over avec de faibles cultures de cellules de passage sera également utile lorsque les cellules présentent des caractéristiques altérées, comme le non-respect, des changements dans la morphologie des cellules (par exemple de rond à grêles et étalées), ou lorsque contamination par des mycoplasmes a été détectée. Un autre point important de faire attention à faire en sorte que les embouts de pipette sont changés entre les échantillons et pendant les dilutions. Cela permettra d'assurer précises dilutions en série et à prévenir la contamination croisée entre les échantillons. L'étape dans le protocole une où le même embout de pipette peut être utilisée à nouveau, c'est quand dilutions en série d'un même échantillon sont ajoutés dans les puits. Dans ce cas, on devrait commencer à partir de l'inoculum plus dilué à tout le moins, et vigoureusement pipette de haut en bas lors de l'élaboration d'une nouvelle dilution.

Le protocole de dosage de la plaque est modifiable à plusieurs modifications. Une modification qui peut être fait lorsque tici ne sont pas assez de cellules pour inoculer des puits en double exemplaire consiste à inoculer qu'un seul puits pour chaque dilution. Toutefois, étant donné le volume d'inoculum est de 0,5 ml, le nombre de plaques doit ensuite être multiplié par un facteur de 2 à normaliser à pfu / ml. Le dosage de la plaque peut également être adapté pour être utilisé avec n'importe quelle autre lignée cellulaire adhérente qui est capable de supporter la réplication de MNV, et cela a été décrit pour la lignée murine microgliale BV-2 ⁸ cellules. D'autres modifications qui peuvent être mises en œuvre sont des adaptations qui ont été décrits pour les protocoles d'essais développés plaque pour d'autres virus. En cas de MNV, les modifications suivantes ont déjà été mis en œuvre avec succès, l'utilisation de la cellulose de méthyle au lieu d'une plaque d'agarose Mer ^9, et la coloration des cellules avec du cristal violet ou bleu de méthylène au lieu de rouge neutre ^{10, 11.}

Dans l'ensemble, ce protocole peut facilement être adapté selon les besoins de quantifier les autres formatrices de plages virus ou utilisés pour other virus qui causent des infections lytiques dans des cellules RAW 264.7, ce qui en fait un outil utile pour quantifier les particules virales infectieuses en général.