الفحص وحة لنوروفيروس الفئران
Summary
نحن هنا وصف طريقة لتحديد جزيئات معدية من نوروفيروس الفئران (MNV)، والذي هو الوحيد الذي يعيد نوروفيروس بكفاءة في الثقافة الخلية. الفحص وحة يستفيد من tropism MNV لالضامة الفئران ويمكن تكييفها للاستخدام مع العينات البيولوجية أو البيئية التي تحتوي على MNV.
Abstract
نوروفيروس الفئران (MNV) هو العضو الوحيد من جنس نوروفيروس التي تنمو بكفاءة في مجال زراعة الأنسجة 1 و 2. تحلل الخلايا وتأثير الاعتلال الخلوي (CPE) لوحظ خلال MNV 1-العدوى من الخلايا الجذعية أو الفئران الضامة 1. ويمكن استخدام هذه الخاصية من MNV-1 لقياس عدد الجسيمات المعدية في عينة معينة عن طريق إجراء فحص لوحة 1. لوحة الفحص يعتمد على قدرة MNV-1 لليز الخلايا وتشكيل ثقوب في الخلايا متموجة أحادي الطبقة، والتي تسمى لويحات 3.
ويمكن استخدام تقنيات متعددة للكشف عن العدوى الفيروسية في مجال زراعة الأنسجة، والأنسجة حصاد والسريرية، والعينات البيئية، ولكن ليس كل قياس عدد جزيئات معدية. (على سبيل المثال QRT-PCR) طريقة واحدة لقياس الجزيئات الفيروسية المعدية هو إجراء فحص لوحة 3 التي سيتم وصفها في التفاصيل أدناه. الاختلاف على فحص لوحة MNV هو فلوريescent مقايسة التركيز، حيث يتم immunostained MNV مستضد في الخلية monolayers 4. يمكن هذا الفحص يكون أسرع، لأن التعبير مستضد الفيروسية تسبق تشكيل اللوحة. ومن المفيد أيضا للفيروسات قادر المعايرة لتشكل لويحات. ومع ذلك، فإن الفحص يتطلب التركيز الفلورسنت موارد إضافية تتجاوز تلك من مقايسة لوحة، مثل الأجسام المضادة والمجهر لحساب التركيز تشكيل وحدة. ويمكن أيضا أن MNV المعدية عن طريق تحديد كمية زراعة الأنسجة 50٪ الجرعة المعدية (TCID 50) 3. هذا الاختبار يقيس كمية الفيروس اللازمة لإنتاج CPE في 50٪ من تلقيح خلايا الأنسجة عن طريق المعايرة نقطة النهاية 5. ومع ذلك، الحد الأقصى للكشف هو أعلى بالمقارنة مع لوحة 4 مقايسة.
في هذه المقالة، ونحن تصف بروتوكول فحص اللوحة التي يمكن استخدامها بشكل فعال لتحديد عدد الجسيمات الموجودة في MNV المعدية العينات البيولوجية أو البيئية 1 و 4 و 6. هذا الأسلوب هو على درجة البكالوريوسالحوار الاقتصادى الاستراتيجى على اعداد من 10 أضعاف التخفيفات مسلسل المحتوية على عينات MNV، والتي تستخدم لتطعيم أحادي الطبقة من الخلايا الإباحية (RAW 264،7 خلايا البلاعم الفئران). يسمح الفيروس لإرفاق أحادي الطبقة الخلية لفترة معينة من الزمن ومن ثم يستنشق قبل تغطي الخلايا بمزيج من الاغاروز وسائل الإعلام والثقافة الخلية. وأجار تمكن من انتشار سلالة الفيروسية للخلايا المجاورة بينما تحد من انتشاره إلى الخلايا تقع بعيدة. وبناء على ذلك، فإن الخلايا المصابة هي lysed والثقوب النموذج في أحادي الطبقة المعروفة باسم لويحات. على انتشار فيروس كافية من لويحات تصبح مرئية تلطيخ التالية من الخلايا مع الأصباغ، مثل الأحمر محايدة، زرقة الميثيلين، أو البنفسجي الكريستال. في التخفيفات المنخفضة، كل لوحة تنبع من الجسيمات الفيروسية المعدية 1 وآله، والتي امتدت إلى الخلايا المجاورة. وهكذا، عد عدد من اللوحات يسمح احد لحساب البلاك تشكيل وحدات (PFU) الموجودة في العينة غير مخفف 3.
Protocol
Discussion
طريقة الفحص لوحة MNV-1 المقدمة هنا هو وسيلة لقياس الجسيمات المعدية MNV. وذلك باتباع الخطوات الفحص موضح في الشكل 3، يمكن للمرء الحصول على التتر الفيروسية استنساخه. الحد من الكشف عن الفحص يعتمد على التخفيف بدءا المستخدمة. عندما بدءا من التخفيف من العينة 1:10 كما هو موضح أعلاه، والحد من الكشف عن لوحة الفحص هو 10 PFU (أي، 1 لوحة مرئية في التخفيف -1 10). لأن كل لوحة تمثل فيروس واحد، ويمكن أيضا أن الفحص البلاك تستخدم في تنقية السكان نسيلي من MNV عن طريق التقاط لوحات معزولة والترويج لها كما هو موضح سابقا 1. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا أن تستخدم لوحة التنقيات لفصل السكان عن فيروس فرد من السكان الفيروس المختلط. وجود قيود من استخدام لوحة فحص للكشف عن الإصابة MNV هو أن ليس كل سلالات MNV تشكل لويحات 4. ومع ذلك، قد يكون من الممكن التغلب على inabiliTY بعض سلالات MNV، معزولة عن الحيوانات، لتشكل لويحات من الركض متسلسل هذه الفيروسات في زراعة الأنسجة 7. بديلا لوحة الفحص هو قياس الجسيمات المعدية عن طريق تقنية 50 TCID 3 و 4. هذا الاختبار الكمي كمية الفيروس اللازمة لإنتاج CPE في 50٪ من تلقيح خلايا الأنسجة بعد التخفيفات نقطة النهاية ويأخذ 1 أسبوع لإكمال لMNV 4. بالإضافة إلى كونه أبطأ من فحص اللوحة، وفحص 50 TCID هي أيضا ليست حساسة (حد الكشف = 200 TCID 50 / مل) نتيجة لسمية عينات الأنسجة إلى خلايا 264،7 RAW 4.
على الرغم من أن وصفت الخطوات الحاسمة في إطار بروتوكول طوال البروتوكول، القسم التالي ملخصا لتسهيل حل المشاكل. الخطوة الأكثر أهمية في البروتوكول هو ضمان أن تبقى الخلايا RAW 264،7 قابلة للحياة في جميع أنحاء مقايسة لدعم تكاثر الفيروس. يمكن هذايمكن رصدها في كل مرحلة من مراحل الفحص عبر المجهر الضوئي. ويكفل بقاء الخلية بطريقتين. أولا، ينبغي الحرص على عدم السماح لتجف الخلايا أثناء التعامل مع لوحات. وهكذا، يتم تلقيح لوحات في وقت واحد، هز خلال الفترة العدوى، ويجب أن تبقى مغلقة كلما أنها لا يجري التعامل معها. ثانيا، ينبغي أن حلول أضاف على خلايا تكون معايرتها إلى ~ 37 ° C. وعلاوة على ذلك، من المهم جدا للمحافظة على الصحة العامة للخلايا 264،7 RAW للحفاظ عليها في وسائل الإعلام التي تحتوي على مصل منخفضة الذيفان الداخلي (<10 EU / مل)، مما يحد من تفعيل الخلايا. وبالإضافة إلى ذلك، لاحظنا ارتفاع معدل فشل الفحص عند استخدام لوحة الخلايا من مرور 30 أو أعلى. ورغم أن هذا سوف تختلف من مختبر إلى المرجح المختبر، من المهم أن تشمل السيطرة الايجابية (على سبيل المثال، مع عينة فيروسية المعروفة عيار) لضمان التتر استنساخه، خاصة عند استخدام الممر أعلى RAW 264،7 الخلايا. للحد من استخدام الخلايا أعلى المرور، فإنه من المستحسن أن تجميد قارورة من أوائل باساجنرال الكتريك الخلايا من الخلايا عند استلام 264،7 RAW وبدء ثقافة جديدة من قوارير المجمدة في كثير من الأحيان. والبدء من جديد مع مرور منخفض مزارع الخلايا يكون من المفيد أيضا عندما تظهر خصائص الخلايا تغييرها، مثل عدم الالتزام، والتغيرات في شكل الخلية (على سبيل المثال من جولة إلى طويل ضعيف وانتشرت)، أو عندما تم الكشف عن تلوث الميكوبلازما. نقطة أخرى المهم أن تولي اهتماما لهو التأكد من أن يتم تغيير نصائح ماصة بين العينات وخلال التخفيفات. وهذا يضمن التخفيفات المسلسل دقيقة ومنع انتقال التلوث بين العينات. خطوة واحدة في البروتوكول حيث يمكن استخدام غيض ماصة هو نفسه مرة أخرى عند إضافة التخفيفات المسلسل لنفس العينة من الآبار. في هذه الحالة، ينبغي للمرء أن يبدأ من اللقاح تضعف معظم لأقل، وماصة صعودا وهبوطا بقوة عند وضعه التخفيف جديدة.
بروتوكول فحص اللوحة هي قابلة للتعديل لعدة تعديلات. واحد التي يمكن تعديلها إلا عندما رهنا لا يكفي لتحصين خلايا الآبار في تكرار لتطعيم فقط هو بئر واحد لكل التخفيف. ومع ذلك، منذ حجم اللقاح هو 0.5 مل، وعدد من اللوحات يحتاج بعد ذلك إلى أن تتضاعف بمعامل من 2 إلى PFU لتطبيع / مل. ويمكن أيضا الفحص وحة تكييفها للاستخدام مع أي خط الخلية تمسكا الأخرى التي هي قادرة على دعم تكرار MNV، ولقد وصفت هذه للخط دبقية الفئران BV-2 الخلية 8. التعديلات الأخرى التي يمكن تنفيذها هي التعديلات التي تم وصفها لبروتوكولات الفحص للبحث عن الفيروسات وضعت لوحة أخرى. في حالة MNV، وقد تم بالفعل إجراء التعديلات التالية نفذت بنجاح، واستخدام السليلوز الميثيل بدلا من البلاك البحر الاغاروز 9، وتلطيخ الخلايا مع البنفسجي الكريستال أو الميثيلين الأزرق بدلا من الأحمر محايدة 10 و 11.
وعموما، يمكن بسهولة أن تتكيف هذا البروتوكول حسب الحاجة لقياس الأخرى المكونة للوحة الفيروسات أو استخدامها لأوراسكوم تليكوم القابضةإيه الفيروسات التي تسبب التهابات في الخلايا التحللي 264،7 RAW، مما يجعلها أداة مفيدة لقياس الجزيئات الفيروسية المعدية بشكل عام.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر أعضاء المختبر Wobus للتعليقات والاقتراحات الهامة. وقد تم تمويل العمل في مختبر CEW من بدء الأموال من جامعة ميشيغان، منحة التطوير الوظيفي من مركز NIH / NIAID إقليمي للتميز في الدفاع والحيوية الناشئة بحوث الأمراض المعدية (RCE) برنامج، منطقة V 'العظمى البحيرات 'RCE (NIH 1-U54 جائزة-AI-057153) وNIH R01 AI080611. MBG-H. بتمويل من المناعة التجريبية (NIH T32 A1007413-16) والآليات الجزيئية الميكروبية في إمراض (NIH T32 A1007528) منح تدريبية لجامعة ميتشيغان. وقد تم تمويل JBC بواسطة دي دي Coordenação Aperfeiçoamento Pessoal فخمة NIVEL دي (CAPES)، برازيليا، البرازيل.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| DMEM/ High glucose | Hyclone | SH30243.02 |
| 2x MEM | Gibco | 11935 |
| 100x Penicillin and streptomycin | Hyclone | SV30010 |
| 10 mM Non-essential amino acids | Hyclone | SH30238.01 |
| 1M HEPES | Hyclone | SH30237.01 |
| 200 mM (100x) L-glutamine | Hyclone | SH30034.01 |
| Fetal Bovine Serum | Gibco, Hyclone | 10437, SH30070.02 |
| Sea Plaque Agarose | Lonza | 50100 |
| Neutral Red 0.33% | Sigma | N2889 |
| 1x PBS | Gibco | 10010 |
| 1.0 mm Zirconia/Silica beads | BioSpec Products | 11079110z |
| Model 35 Speed Rocker | Labnet | S2035 |
| Magna Lyser Instrument | Roche | 03358968001 |
| Raw 264.7 cell line | ATCC | TIB-71 |
| Tissue culture incubator | Sanyo | MCO-18AIC |
Referencias
- Wobus, C. E. Replication of Norovirus in cell culture reveals a tropism for dendritic cells and macrophages. PLoS Biol. 2, e432 (2004).
- Wobus, C. E., Thackray, L. B., Virgin, H. W. Murine norovirus: a model system to study norovirus biology and pathogenesis. Journal of virology. 80, 5104-5112 (2006).
- Condit, R. C., Knipe, D. M., Howley, P. M. Ch. 2. Fields Virology. 1, 25-58 (2007).
- Thackray, L. B. Murine noroviruses comprising a single genogroup exhibit biological diversity despite limited sequence divergence. Journal of virology. 81, 10460-10473 (2007).
- Reed, L. J., Muench, H. A simple method for estimating 50% endpoints. American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1932).
- Chachu, K. A. Antibody is critical for the clearance of murine norovirus infection. Journal of virology. 82, 6610-6617 (2008).
- Barron, E. L. Diversity of murine norovirus strains isolated from asymptomatic mice of different genetic backgrounds within a single U.S. research institute. PLoS ONE. 6, e21435 (2011).
- Cox, C., Cao, S., Lu, Y. Enhanced detection and study of murine norovirus-1 using a more efficient microglial cell line. Virology journal. 6, 196 (2009).
- Cooper, P. D. The plaque assay of animal viruses. Adv. Virus Res. 8, 319-378 (1961).
- Hyde, J. L. Mouse norovirus replication is associated with virus-induced vesicle clusters originating from membranes derived from the secretory pathway. Journal of virology. 83, 9709-9719 (2009).
- Simmonds, P. Bioinformatic and functional analysis of RNA secondary structure elements among different genera of human and animal caliciviruses. Nucleic acids research. 36, 2530-2546 (2008).
