L'élevage et de l'injection de<em> Manduca sexta</emLes larves> pour évaluer la virulence bactérienne
Summary
La méthode décrite ici utilise l'injection directe de bactéries entomopathogènes dans le hémocèle de<em> Manduca sexta</em> Les larves d'insectes.<em> M. sexta</em> Est un insecte disponible dans le commerce et bien étudié. Ainsi, cette méthode représente une approche simple pour analyser les interactions hôte-bactéries du point de vue de l'un ou des deux partenaires.
Abstract
Manduca sexta, communément connu sous le sphinx du tabac, est considéré comme un ravageur agricole important, se nourrissant de plantes solanacées, dont le tabac et la tomate. La susceptibilité de M. larves sexta à une grande variété d'espèces bactériennes entomopathogènes 1-5, ainsi que la richesse des informations disponibles sur le système immunitaire de l'insecte 6-8, et la séquence du génome attente 9 rendent un organisme bon modèle pour une utilisation dans l'étude des interactions hôte-microbe au cours de la pathogenèse. En outre, M. larves sexta sont relativement grands et faciles à manipuler et à entretenir dans le rapport de laboratoire sensibles à d'autres espèces d'insectes. Leur grande taille facilite aussi efficace tissus / hémolymphe d'extraction pour l'analyse de la réponse de l'hôte à l'infection.
La méthode présentée ici décrit l'injection directe de bactéries dans le hémocèle (cavité sang) de M. larves sexta. Cette approchepeut être utilisé pour analyser et comparer les caractéristiques de virulence de diverses espèces bactériennes, les souches, ou des mutants par simple surveillance du temps de mort de l'insecte après l'injection. Cette méthode a été développée pour étudier la pathogénicité de Xenorhabdus et des espèces Photorhabdus qui associent généralement avec les nématodes vecteurs comme un moyen de gagner l'entrée dans l'insecte. Les nématodes entomopathogènes infectent généralement les larves via digestive naturelle ou orifices respiratoires, et de libérer leurs contenus symbiotiques bactériens dans l'hémolymphe des insectes (sang) peu de temps après 10. Le procédé d'injection décrits ici contourne la nécessité d'un nématode vecteur, ainsi découpler les effets des bactéries et des nématodes sur les insectes. Cette méthode permet à l'énumération précise des matières infectieuses (cellules ou protéines) dans l'inoculum, ce qui n'est pas possible à l'aide d'autres méthodes existantes pour l'analyse entomopathogenesis, y compris entaille 11 et des essais de toxicité orale 12 <em>. Aussi, les essais de toxicité orale face à la virulence des toxines sécrétées introduites dans le système digestif des larves, alors que la méthode d'injection directe porte sur la virulence de la cellule entière inoculums.
L'utilité de la méthode d'injection directe comme décrit ici est d'analyser la pathogenèse bactérienne en surveillant la mortalité des insectes. Cependant, cette méthode peut facilement être étendu pour une utilisation dans l'étude des effets de l'infection sur la M. sexta système immunitaire. L'insecte réagit à l'infection par les deux réponses humorales et cellulaires. La réponse humorale comprend la reconnaissance de bactéries associées aux modèles et la production subséquente de plusieurs peptides anti-microbiens 7; l'expression de gènes codant pour ces peptides peut être surveillée à la suite de l'infection directe par l'intermédiaire d'extraction d'ARN et PCR quantitative 13. La réponse cellulaire à l'infection implique la nodulation, l'encapsulation et la phagocytose des agents infectieux par les hémocytes 6 </sup>. Pour analyser ces réponses, les insectes injectés peuvent être disséqués et visualisées par microscopie 13, 14.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'injection directe de M. larves avec des bactéries entomopathogènes sexta, comme décrit ici, sert comme un moyen simple et efficace pour analyser la virulence bactérienne. La méthode est également très adaptable à différents sujets de l'expérience et / ou des conditions. Les bactéries peuvent être préparés de diverses façons avant l'injection. Dans le cas de X. nematophila, les cellules de type sauvage cultivées dans riche en nutriments Luria-Bertani (LB) à la mi-…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier les anciens membres du laboratoire de Goodrich-Blair: Samantha Orchard, Kimberly Cowles, Erin Herbert-Tran, Greg Richards, Megan Menard, et Youngjin parc pour leurs contributions à l'élaboration de ce protocole. Ce travail a été financé par la National Science Foundation subvention IOS-0950873 et le National Institutes of Health NRSA FAI084441Z bourse.
Materials
| Reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 90 mm filter paper | Whatman | 1001 090 | |
| Glass filter holder | Millipore | XX1004700 | |
| Manduca sexta eggs | Carolina Biological Supply | 143880 | |
| Gypsy Moth Diet + agar | MP Biomedicals | 0296029301 | |
| 5.5 oz. plastic containers and lids | Solo Cup Company | URC55-0090 Pl4-0090 | |
| 1 oz. plastic containers and lids | DART Container Corporation | 100PC 100PCL25 | |
| 1x PBS | 137 mm NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1.46 mM KH2PO4, pH 7.4 | ||
| Syringe | Hamilton | 80208 | 30 gauge, 0.375″ length, point style 2 |
Referencias
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