Cep Takip Boyalar kullanarak Hücre Bölünmesi İzleme için optimize Boyama ve Çoğalma Modelleme Yöntemleri

PKH26 gibi Membran boyaların hücre zarının içine ziyade kimyasal reaksiyon (KAKE için) veya denge bağlanma (antikor) tarafından neredeyse anlık bölümleme ile leke. Şekil 1 'de belirtilen kritik konuya dikkat eksikliği, Şekil 2' de gösterilen tipteki bulanık ya da heterojen bir boyama meydana gelebilir. Buna karşılık, (Şekil 1, Tablo 2) optimize edilmiş etiketleme koşulları boya seyreltme (Şekil 3) dayanan hücre bölünmesini kontrol de dahil olmak üzere hücre izleme çeşitli uygulamalar için uygun parlak homojen dağılımı ile sonuçlanır kullanır. Ölü / ölen bu hücreleri genişletmek ve / veya eğriltme kızı nesil şiddetleri ve boya seyreltme 3,4,16,18 esas yayılması modelleme karmaşıklaştırıyor izleme boya miktarları, değişen kaybeder. Ölü hücrelerin önemli sayıda önceden edilebilir koşullar altında boya seyreltme veri toplarken bir canlılık boya kullanın nedenle tavsiye edilirBöyle uyarılmış kültürleri (Şekil 3) veya daha büyük numuneler (Şekil 4) olarak gönderilir. Boya etiketleme izleme tipik floresan yoğunlukları immünofenotipleme büyükse birkaç büyüklük verir Çünkü, uygun bir tazminat kontrolleri (Tablo 1) dahil etmek ve boya izleme varlığı antikoru pozitif ve negatif hücre (Şekil çözmek için yeteneği bozulma olmadığını doğrulamak için önemlidir 4). aşırı renk telafisi için ihtiyaç önlemek için, izleme boya bitişik spektral kanal içinde bir parlak florokrom, ya da bu gibi canlı hücreler tarafından hariç bir boya olarak ilgi hücreleri üzerinde bulunan bir tane değil, (s) yerleştirmek tercih edilir, (Şekil 4A & B vs. 4C-Ge). Iyi bir uyum elde, çoğalma ölçüde ölçmek için pik modelleme yazılımı kullanırken boya seyreltme prof özelliklerine modeli içinde eşleşen varsayımlar gerektiririles (Şekil 5 ve Tablo 3) analiz edilmektedir. Izleme boyalar ve canlılığı reaktiflerin uygun şekilde seçimi ile, aynı anda birden fazla lenfosit alt proliferatif yanıtları karakterize etmek de mümkündür. Şekil 6 içinde gösterildiği gibi, örneğin, bir 2 izleme boya ilave düzenleyici T hücreleri (CellVue Bordo ile etiketlenmiş) ve yüksek oranda çoğalmıştır efektör T hücreleri arasındaki ayrım basitleştirir (CFSE ile etiketlenmiştir) ile elde edilebilir göre olan etkileşimleri ile ilgili çok daha fazla detay sunar 3 H-timidin etiketleme 18,27 kullanarak. Şekil 1. PKH26, PKH67 ve CellVue boyalar için Genel membran etiketleme protokolü. Hücre zarı içine bu oldukça lipofilik boyalar Bölümlemeeşya boyama çözünürlük ve boya boyama etkinliğini maksimize etmek, sunulan tuzsuz Seyreltici C araç içinde gerçekleştirilir hücreleri ile karıştırma üzerine esasen anında meydana gelir. PKH26 ile genel zar etiketleme için bu şematik de özetlendiği gibi, parlak, homojen ve tekrarlanabilir bir boyama bundan dolayı en kolay şekilde elde edilir: 1) garantiler bir karıştırma tekniği kullanılarak) boyanma adım 2'de mevcut protein ve / veya tuzlarının miktarının en aza indirilmesi boya hücrelerin hızlı homojen dağılımı (yani, aynı anda boya ile aynı konsantrasyon için bütün hücrelerin ortaya koyar). Şekil 2. PKH26 floresans dağılımları (Ref yeniden basıldı. 18) üzerine şartları boyama Etkisi. Logaritmik büyüyen, kültürlü U örnekleri ÇoğaltIle ya da boya 2x 2x hücrelerin üzerine ilave hemen karıştırma olmadan, oda sıcaklığında 3 dakika için: – 937 hücreleri PKH26 (15 uM PKH26 1 x 10 7 hücre / ml, 12 nihai konsantrasyonlar) ile boyandı. Yıkadıktan sonra, boyanan hücreleri alet sabiti ayarları kullanarak bir Beckman Coulter camgöbeği akış sitometresinde analiz edilmiştir Histogram 1:. PKH26 Dedektör gerilimi ile boyanmamış kontrolü birkaç / hayır hücreleri ilk kanal biriken ile ilk on yılda ölçekte tüm hücreleri yerleştirmek için ayarlanabilir. Histogram 2: Derhal karıştırma ile boya 2x 2x hücrelerinin ek kullanarak 15 mcM boya boyanması birkaç / son kanal biriken hiçbir hücre (gMFI = ile, parlak, homojen boyanmış, dördüncü on yerleştirilen hücrelerinin simetrik nüfus sonuçlandı . 2548, GCV =% 26.2) Histogram 3: boya 2x 2x hücrelerinin ek kullanarak 15 mcM boya az ama hemen karıştırma olmadan boyanması yoğunluğu azaltılmış sonuçlandı ve daha geniş bir CV (gMFI = 505 , GCV =% 116) hem de boru çeperi üzerinde yerine 2x boya çözeltisi içine dağıtılan hücreler bir düşüş nedeniyle muhtemelen bir loş lekeli alt populasyonun, Histogram 4:. Bir boyama hata konsantre etanolik boya 3 ul yol açmıştır stok daha ziyade bu 12 mcM nihai boya konsantrasyonu ile sonuçlanmıştır Dilüent C. 2x boya çözeltisi hazırlamak için kullanılan daha karıştırmadan Dilüent C hücreleri 2x doğrudan eklenmiş ama son derece loş ve heterojen boyanma (verdi ediliyor gMFI = 32.9, GCV % = 1020). Sağa skew büyük olasılıkla kombine etkilerini yansıtan gözlenen: i) düşük geniş ölçüde farklı hücre ve boya hacmi nedeniyle karıştırma ve ii) boya dağıtma noktasına en yakın hücreleri öteye daha boya daha yüksek bir konsantrasyonuna maruz kalacağı aslında uzaklıkta. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın . re 3 "src =" / "fo: content-width =" files/ftp_upload/4287/4287fig3.jpg 4.5in "fo: src =" / files/ftp_upload/4287/4287fig3highres.jpg "/> Şekil 3,. Canlılık sonda kullanılması T-hücresi çoğalması profillerin gating basitleştirir hPBMC PKH26 (nihai hücre yoğunluğu: 3×10 7 / ml nihai boya yoğunluğu: 10 uM) ile işaretlendi.. 96. varlığında saat (uyarılan) veya anti-CD3 ve IL-2 yokluğu (uyarılmamış) için kültür sonra, hücreler, anti-CD3-FITC, anti-CD19-APC ve 7-AAD ile zıt edildi ve analiz edildi FACSCalibur flowsitometri (ayrıntılar için referans 13). Renk kompanzasyon kablolu kompanzasyon devresi kullanarak veri toplama sırasında yapıldı. ModFit LT3.3 içinde çoğalması Sihirbazı kullanılarak Aşama 4'te tarif edildiği gibi çoğalma derecesi, modellenmiştir. PKH26 neg kontrolü (Tablo 1, Tüp 7) Veri referans (sütun 3 gri doldurulmuş histogramlar) için üst üste. Uyarılmamış için canlılığı ve stimulated kültürler% 76 ve% 62 (paneller için ungated veri A ve B) idi. ortam içinde 96 saat süre ile kültüre Panel A. PKH26 boyalı hücrelerin uygun (7-AAD neg), CD3 kutuplu hücreler (R1) içerecek şekilde işlenir edildi. Antikor içerme ve 7-AAD ölü hücre dışlama kapısına ek olarak, bir ileri saçılım (FSC) karşı yan dağılım (SSC) kapısı (R2) enkaz ve agrega dışlamak için kullanıldı. Bu panelde son arsa ölü hücrelerin olmadığına dikkat edin. PKH26 çoğalması profili (sütun 3) için en uygun modeli RCS = 2.1 (Donör 6, Tablo 3), gösteren iyi bir simetri ile tek bir pik verdiği ve ebeveyn konumunu tanımlamak için kullanılan ve uyarılmış analizi için pik genişliği başlangıç ​​oldu Bu veri kümesi (Panel B) numune. Panel B. PKH26 boyalı hücrelerin bir alikotu tekrarında yüzer tepe pozisyon ile bir model Panel A. de olduğu gibi aynı şekilde işlenir ve 96 saat için, anti-CD3 ve IL-2 ile kültüre edildi ve yüzer pik genişliği verdi RCS = 1.3 (Donör 6, Tablo 3). Panel C. A 7-AAD verilerin kullanımı olmadan analiz edildi Masası'ndaki gibi aynı veri dosyası ile bu veriler için en uygun. Birincil FSC vs SSC kısmen ölü hücreleri ve agrega (R2) ve CD3 pozitif olaylar (R3) seçmek için bir tali kapısı dışlamak için kullanılan zaman, ölü hücrelerin küçük bir kalıntı nüfus (Geçitli olayların% 0,2) kalmıştır. En uygun modeli (Geçitli olayların% 1,29) uyarılmış numune ölü hücrelerin büyük rezidüel nüfus Not Panel C gibi Masası'ndaki olarak B Geçitli RCS = 2.2. Panel D. aynı veri dosyası tek bir pik verdiği Bu yolluk strateji. En uygun modeli kayan pik konumu ve kayan tepe genişliği (RCS = 1.3) ile biriydi. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın . ig4.jpg "fo: content-width =" 5in "fo: src =" / files/ftp_upload/4287/4287fig4highres.jpg "/> Şekil 4. Florokrom seçim ve PKH26 ile etiketlenmiş immünfenotip lenfositler yeteneği üzerindeki boya konsantrasyonunun etkisi. HPBMC 24 saatlik eski kandan izole edilen ve boyama 12 x 75 mm yuvarlak dipli içinde gerçekleştirildiği durum ile, adım 1 'de tarif PKH26 ile işaretlendi polistiren tüpler oldukça 12 x 75 mm'lik polipropilen tüplere göre konik. Hemen PKH26 ile etiketleme sonrasında, hücrelerin belirtilen immünofenotipik ve canlılığı reaktifleri ile zıt ve Şekil 3A yolluk strateji ve aşağıdaki optik yapılandırmayı kullanarak bir LSRFortessa akış sitometresinde analiz edildi: 488 nm lazer: FSC-A (488 nm); SSC -A (488/10 BP), FITC-A (530/30 BP), PKH26-A (575/26 BP), 7-AAD-A veya PerCP-A (695/40 BP). 640 nm lazer: APC-A veya Topro-3-A (670/14 BP). Renk kompanzasyon BD DiVa yazılımı kullanarak veri toplama sırasında yapıldı. "Otomatik"(paneller C ve D için A ve B, PerCP paneller için APC), ilgili spektral pencerede no-antikor kontrolü otofloresans gösterir. PKH26 neg kontrolü (Tablo 1, Tüp 7) Veri referans (gri dolu histogramlar, sütun 5) üst üste. Post-boyama canlılığında bütün numuneler (88-92%) için benzer idi. 2 uM bir nihai konsantrasyonda PKH26 ile etiketlenmiş Panel A. Hücreler, anti-CD3-FITC, anti-CD4-, APC, ve 7-AAD (kullanarak zıt edildi Tüp Tablo 3 'de 8). Canlı üzerinde yolluk (7-AAD neg) CD3 pos lenfositler (Sütun 1) ve enkaz ve FSC ve SSC (Şekil 3A) temel alınarak agregaların bırakılmasından sonra PKH26 yoğunluğu APC CD4 (Kolonlar 2 ve 3) ile birlikte değerlendirildi. Dengelenmemiş (sütun 2) ya da (sütun 3) telafi olsun, bu kombinasyon florokrom) CD4 pos CD4 T hücreleri ve negatif T-hücreleri arasında iyi çözünürlük ile sonuçlanmıştır, hem bir no-a ile doğrulanmışntibody, autofluorescent kontrolü (Tablo 1 Tüp 6; Sütun 4) ve CD3 vs iki renkli arsa. CD4 (Sütun 6). Panel B'de. Paneli aynı florokrom kombinasyonu olarak kullanılması, ancak 4 uM son PKH26 konsantrasyonu arttırarak olumsuz CD4 neg T hücreleri CD4 Poz T hücreleri gidermek için yeteneğini etkileyebilir vermedi. Paneli C. bağımsız olarak 2 uM bir nihai konsantrasyonda PKH26 ile işaretli hücrelerin tekrarında kısım, anti-CD3-FITC, anti-CD4-PerCP ve Topro-3 kullanılarak zıt edildi. Canlı (Topro-3 neg) CD3 pos lenfositler (Sütun 1) ve enkaz ve FSC ve SSC (Şekil 3A) temel alınarak agrega dışlama yolluk sonra PKH26 yoğunluğu anti-CD4-PerCP (Sütun 2 ve birlikte değerlendirildi 3). PerCP kanal içine PKH26 önemli spektral örtüşme kompanse verileri (sütun 2) belirgin ve PKH26 pos CD4 arasındaki çözünürlük <sutelafi (sütun 4'te gösterilen herhangi bir antikor, autofluorescent kontrol ile sütun 3 karşılaştırın) uygulandıktan sonra, p> pos ve CD4-negatif PKH26 pos etkinlik sınırda. Panel D. PKH26 konsantrasyonu 4 uM arttırılır, bu artık mümkün değildir PerCP kanal içine PKH26 Panel C. spektral örtüşme florokrom arada kullanmak için CD4 (Sütun 2) CD4 ve gelen sinyalin yoğunluğu aşar pos PKH26 kutuplu olaylar artık CD4-negatif PKH26 ikinci konum T-hücrelerinde (sütun 3 çözülebilir vs. Sütun 4). büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın . Şekil 5,. Üzerine proliferasyonu model seçimi Etkisi. boya dilüsyon profilleri için uyum iyiliği hPBMC PKH26 (:; nihai boya konsantrasyonu 3×10 7 / ml: 10 uM son hücre konsantrasyonu) ile işaretlendi. 96. varlığında saat (uyarılan) veya anti-CD3 ve IL-2 yokluğu (uyarılmamış) için kültür sonra, hücreler, anti-CD3-FITC, anti-CD19-APC ve bir FACSCalibur 7-AAD ve analiz ile zıt hasat edilmiştir flowsitometri (ayrıntılı yöntemler için Başvuru 13). Renk telafi kablolu telafi devresi kullanarak veri toplama zamanında gerçekleştirildi. Panel A, Şekil 3A'da gösterilen ve ModFit Proliferation sağlamak için kullanılan gibi. Donor 5, bir orta yanıtlayıcı, bir uyarılmamış 96 saat kültüre PKH26 yoğunluk profili geçişli . Panel B bölünmemiş ebeveyn hücreleri temsil eden zirve için konumu ve genişliği bir ilk tahmin olan Sihirbazı. paralel gelen PKH26 yoğunluk profili 96 saat kültürü teşvik den başlayan tahminleri kullanılarak analiz edildiGösterildiği gibi izleyen kızı nesiller için Panel A ve 4 sabit veya yüzer pik şiddetleri karşılık 'Silahların Sihirbazı' ayarlarını farklı birleşimlerini, ve sabit veya yüzer tepe genişlikleri. Tablo 3, gözlemlenen veri için en uygun verdi modeli özetlenmiştir (düşük indirgenmiş chi-square; RCS) pik pozisyonları aynı zamanda kızı nesil doruklarına standart sapmaları değil sadece izin edildiği "yüzen / yüzen" kombinasyon oldu değişir (RCS = 1.5). Aynı model Donor 6, bir yanıt veren (Şekil 3B ve Tablo 3) için en uygun verdi. Şekil 6. İkinci bir cep izleme boya ilavesi akım sitometri baskılama testinde efektör ve düzenleyici T hücreleri arasındaki ayrım kolaylaştırır. TRIMA lökaferezis filtreleri hazırlanan Monosit-tüketilmiş lenfositlerin anti-CD127-PE, anti-CD4-PE-Cy7 ile boyandı (. 18 Ref uyarlanmış), ve anti-CD25-APC ve akış efektör (Teff popülasyonları içine sıralanır; CD4 pos CD127 parlak CD25 dim), düzenleyici (Treg; CD4 pos CD127 loş CD25 pos), ve aksesuar (CD4 neg) hücreleri. KAKE (son hücre konsantrasyonu: 5 × 10 7 / ml; nihai boya konsantrasyonu, 5 mcM) ile etiketlenmiş ve kriteri Teff:;: CellVue Claret (1 uM son boya konsantrasyonu 1×10 6 / ml son hücre konsantrasyonu) ile etiketlenmiş kriteri Treg hücreler oldukları , anti-CD3, anti-CD28 ve ışınlanmış aksesuar hücrelerin varlığında, değişen oranlarda da ko-kültive. 96 saat sonra, kültürler hasat edildi, anti-CD4-PE-Cy7 ve ölü / canlı tamir edilebilir Violet ile zıt ve bir LSRII akış sitometresi ve renk dengeleyici üzerinde analiz verileri acquisitio sırasında gerçekleştirildin BD DiVa yazılımı (tazminat kontrolleri dahil olmak üzere ayrıntılı bilgi için Başvuru 18 bakınız). Aşama 4'te tarif edildiği gibi Teff ve Treg için proliferasyon indeksi ModFit LT3.3 içinde çoğalması Sihirbazı kullanılarak, örnek alınmıştır. Paneller B ve C Veri noktaları nüsha örneklerinin ortalama ± 1 standart sapma temsil Panel A. Örnek veriler Treg az üç nüsha örnekleri biri için gösterilir:. 0.25:1 arasında Teff oranı. Tüm diğer veri parsellerden; LIVE / DEAD tamir edilebilir Menekşe reaktifi ölü hücreleri (= kırmızı-kahverengi, cansız Teff = gri ve cansız Treg = kırmızı aksesuar hücreleri R1, sol üst arsa) dışlamak için kullanıldı. CellVue Claret boyama canlı Treg (R4, merkez sağ arsa; mavi) ayırt etmek için kullanılan geçerli değil ama oldukça Teff (R5, merkez sağ arsa; yeşil) çoğaldı. Teff (sol alt arsa) için tek bir parametre KAKE çoğalması profili KAKE pos (R5), canlı CD4 pos (R3), (değil R1) idi hücreleri üzerinde yolluk tarafından oluşturulan ve lenfosit sc vardıardıl özellikleri (R2). Treg için tek bir parametre CellVue Claret çoğalması profili CellVue Claret pos (R4), canlı CD4 pos (R3), (değil R1) idi hücreleri üzerinde yolluk tarafından oluşturulan ve lenfosit dağılım özellikleri (R2) vardı. Lenfosit patlamaların içerecek şekilde tanımlanmış cömert lenfosit bölgesi (R2) unutmayın. Toplanan hücrelerin toplam sayısını ilgi, en düşük frekans nüfus bağlı olduğu da not edin. İlgilenilen popülasyonun yedi ya da sekiz hücre nesilleri arasında, bir çok sayıya kadar temsil yoğunluğu geniş bir yelpazesi üzerinde dağıtılabilir bir hücre proliferasyon deneyde doğru modeli ve her kuşakta hücre sayısını hesaplamak için toplanmalıdır. Nadir hücrelerinin öğrenim görürken, sadece olayların mümkün olan maksimum sayıda toplamak için neredeyse kuru numune tüpü çalıştırmak için gerekli olabilir. Burada gösterilen örnek için, bu iş 11,923 Teff tane olmak üzere toplam ~ 25,000 olayları, (Proliferation bir toplam sonuçlanmıştırndex 3.85) ve 1.380 Treg (proliferasyon indeksi 1.83) olarak bulundu. Panel B., beklendiği gibi, Teff hücre proliferasyonunu büyük bir bastırma yol açmıştır eş-kültür içinde Tregs mevcut oranını artırmaktadır. Benzer sonuçlar potens Treg etkilemedi CellVue Claret izleme boya ile bu boyanma gösteren CellVue Bordo-lekeli (düz çizgi) veya boyanmamış (kesikli çizgi) Treg iki ile elde edilmiştir. Panel C Treg beklendiği gibi, nispeten anerjik ve yaptım, Teff hücrelerin yokluğunda (1:0 arasında Teff oran Treg) anti-CD3, anti-CD28, ve yardımcı hücreleri ile inkübe zaman çoğalırlar değildir. Ancak, ko-kültürler içinde Teff mevcut olan oran (yani, Treg olarak: Teff oranı düşürülebilir) artış, Treg çoğalma ölçüde artmıştır. En azından kısmen, bu veriler için genel olarak daha büyük bir hata çubukları, belirsiz Teff göre toplanmış ve daha fazla olay daha az sayıda yol açan, çoğalma sınırlı ölçüde yansıtmakHer nesil hücrelerinin sayısında modellenmesinde ty. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın . Tüp No (Amaç) PKH26 Antikor (ler) 7-AAD 1 (Kur, tazminat) – – – 2 (Kurulum, tazminat) + – – 3 (Kurulum, tazminat) – – + 4 (tazminat) – CD8-FITC b – 5 (tazminat) – CD8-APC b – 6 (hayır Ab kontrolü) + – + 7 (hayır izleme boya control) – CD3-FITC CD4-APC veya CD19-APC c + 8 (T0 kontrolü) + CD3-FITC CD4-APC veya CD19-APC c + . Tablo 1 Enstrüman Ayar Kontrolleri a kullanarak 4-renk CD4 T hücre proliferasyonunu izleme denemesi için uygun listelenen Denetimleri:. PKH26 (proliferasyon boya), CD3-FITC (pan-T hücre belirteci), CD4-APC (T-helper hücre belirteci), 7-aminoactinomycin D (7-AAD; ölü hücre dışlama) b CD3-FITC ve CD4-APC Parlak suretler (tazminat hataları tespit etmek için daha iyi bir yetenek c) Şekil 3:.. CD3-FITC ve CD19-APC. d Şekil 4: CD3-FITC ve CD4-APC. Hücre tipi Nihai Hücre Konsantrasyon Nihai Boya Konsantrasyonu </Strong> Referans hPBMC b 1 x 10 7 / ml 2 mcM PKH67 10,17 5 x 10 6 / ml 2 mcM PKH26 12 3 x 10 7 / ml 10 uM PKH26 13 5 x 10 7 / ml ' 30 uM PKH26 18 1 x 10 6 / ml 1 uM CellVue Claret c 18 3 x 10 7 / ml 4 mcM CellVue Claret 13 5 x 10 7 / ml ' 5 uM CellVue Claret 18 Hücreler kültür içinde 5 x 10 5 / ml 0.1 uM PKH26 (1 ° meme hücreleri) 8 1 x 10 7 / ml 15 uM PKH26 (U937) 18 1 x 10 7 / ml 12.5 -15 uM PKH26 (U937) 15 1 x 10 7 / ml 1 uM PKH67 (K562) 18 1 x 10 7 / ml 1 uM PKH67 (T hücre soyu) 9 1 x 10 7 / ml 10 uM CellVue Bordo (YAC-1) 23 Tablo 2. Olmayan dalgalanmayla Membran-Boya Boyama Koşullar a. Bir Uyarlanmış ve Ref güncellendi. 18 b. Karışım düşük devirli yıkama (300 xg) trombosit kontaminasyonu en aza indirmek için kullanılmıştır. C Treg hücreleri (akış kriteri CD4 pos CD25 pos CD127 neg lenfositler). Model Ayarları <td colspan = "6"> Model Sonuçları Verici Tedavi Tepe Noktası SD Ebeveyn Pozisyon Ebeveyn SD # Peaks Fitted RCS PI PF 5 Uyarılmamış Şamandıra Şamandıra 209 4.5 1 5.1 1.0 0 5 Uyarılmış Sabit Sabit 209 <td> 4,5 7 35 3.9 31 5 Uyarılmış Şamandıra Sabit 209 4.5 8 19 4.3 30 5 Uyarılmış Sabit Şamandıra 209 9.2 6 1.9 3.8 30 5 Uyarılmış Şamandıra Şamandıra 209 9.0 7 1.5 3.7 29 6 Uyarılmamış Şamandıra Şamandıra 205 4.0 1 2.1 1.0 0 6 Uyarılmış Sabit Sabit 205 4.0 6 42 6.6 60 6 </td> Uyarılmış Şamandıra Sabit 205 4.0 7 12 7.4 60 6 Uyarılmış Sabit Şamandıra 205 8.6 6 6.9 6.8 62 6 Uyarılmış Şamandıra Şamandıra 205 6.5 6 1.3 6.5 59 Tablo 3. Yiligi (RCS) ve Çoğalma Ölçümleri Şekil 3A ve B açıklandığı gibi. Örnek boyama, veri toplama ve yolluk üzerine Proliferation Modelinin Etkisi.