셀 추적 염료를 사용하여 전지 부문 모니터링에 최적화 된 착색 및 확산 모델링 방법

PKH26 같은 막 염료는 세포 멤브레인에보다는 화학 반응 (CFSE) 또는 평형 바인딩 (항체)을하여 가까운 순간 파티션으로 얼룩. 그림 1에서 설명하는 중요한 문제에 관심의 부족은도 2에 도시 된 유형의 희미하거나 이기종 착색 될 수 있습니다. 반면, (그림 1, 표 2) 최적화 된 라벨 조건의 염료 희석 (그림 3)에 따라 세포 분열 모니터링을 포함한 셀 추적 응용 프로그램의 다양한 적합 밝은 균일 한 분포의 결과를 사용합니다. 죽은 / 죽어 셀 폭이 넓어 및 / 또는 왜곡 딸이 생성 농도와 염료 희석 3,4,16,18에 따라 확산 모델링을 복잡하게 할 수 있습니다 추적 염료의 양을, 다양한 잃게됩니다. 죽은 세포의 중요한 번호는 미리 할 수​​ 있습니다 조건 하에서 염료 희석 데이터를 수집 할 때 생존의 염료의 사용은 따라서 권장합니다이러한 자극의 문화 (그림 3) 이상 표본 (그림 4)로 보냈습니다. 염료 라벨을 추적하는 것은 일반적으로 형광 강도에게 immunophenotyping보다 더 큰 규모의 여러 주문을 할 수 있기 때문에 적절한 보상 컨트롤 (표 1)를 포함하고 염료를 추적의 존재가 항체 긍정적이고 부정적인 세포를 (그림 해결 할 수있는 능력을 저해하지 않는 있는지 확인하는 것이 중요합니다 4). 과도한 색상 보정의 필요성을 방지하려면, 그것은 추적 염료에 인접 스펙트럼 채널에 밝은 fluorochrome, 또는 라이브 세포에 의해 제외 염료로 관심 세포에서 찾을 수 없습니다 하나 (들)을 배치 바람직합니다 (그림 4A & B VS. 4C & D). 적합한를 획득, 확산의 정도를 수량화하기 위해 최대 모델링 소프트웨어를 사용하는 경우는 염료 희석 교수의 특성에 모델 내에서 일치 가정을 필요로iles는 (그림 5 표 3) 분석된다. 추적 염료와 생존의 시약의 적절한 선택과 동시에 여러 림프구 subpopulations에 proliferative 응답을 특징하는 것도 가능합니다. 그림 6에 도시 된 바와 같이 예를 들어, 둘째 추적 염료의 추가는 규제 T 세포 (CellVue 피와 함께 표시) 및 높은 확산 효과기 T 세포 사이의 차별을 단순화 (CFSE로 표시)과 얻을 수있는 것보다 자신의 상호 작용에 대한 훨씬 더 자세한 정보를 제공합니다 3 H-thymidine 라벨 18,27을 사용합니다. 1 그림. PKH26, PKH67 및 CellVue 염료 일반 멤브레인 라벨 프로토콜. 세포 membra에 이러한 높은 lipophilic 염료의 파티션선은 착색이 염료 용해도 및 착색 효율을 극대화하기 위해 제공 소금 무료 희석제 C 차량에서 수행되는 세포와 혼합시 즉시 근본적으로 발생합니다. PKH26와 일반 막 라벨이 도식에 요약으로, 밝고, 균일하고 재현 착색 따라서 가장 쉽게 얻은 것입니다 : 1) 처리됩니다 혼합 기술을 사용) 착색 단계 2에서 제시 단백질 및 / 또는 소금의 양을 최소화 염료의 세포의 급속한 균일 한 분산 (즉, 동시에 염료의 동일한 농도에 대한 모든 세포를 제공합니다). 그림 2. PKH26 형광 배포판 (참조에서 재. 18)에 대한 조건을 얼룩의 효과는. logarithmically 성장, 교양 U의 샘플을 복제이나 염료를 2 배하는 배 세포의 추가에 따라 즉시 혼합하지 않고, 주위 온도에서 3 분을 위해 : – 937 세포는 PKH26 (15 μM PKH26 1 개 10 7 세포 / ML, 12 최종 농도) 물들되었습니다. 세척 후, 스테인드 세포는 일정한 악기 설정을 사용하여 Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날 시안 흐름 cytometer에 분석 된 히스토그램 1. PKH26 검출기 전압 흠없는 컨트롤이 몇 / 더 셀 첫 번째 채널에 축적되지과 함께 첫 10 년에 규모의 모든 셀을 배치 조정. 히스토그램 2 : 즉시 혼합으로 염료를 배에 배 셀의 추가를 사용하여 15 μM의 염료의 염색은 몇 / 마지막 채널에 축적없이 세포 (gMFI =와, 밝은, homogenously 스테인드, 네 번째 년대에 배치 세포의 대칭 인구 결과 . 2,548, gCV = 26.2 %) 히스토그램 3 : 염료를 배에 배 셀의 추가를 사용하여 15 μM의 염료에 있지만, 즉각적인 혼합없이 착색이 감소 강도를 높이고 폭 넓은 CV (gMFI = 505 , gCV은 = 116 %)뿐만 아니라 관의 벽에보다는 2 배 염료 솔루션에 투여 셀의 드롭로 인해 어렴풋이 스테인드 subpopulation, 히스토그램 4. 착색 오류가 농축 에탄올 염료의 3 μl으로 이어 재고가 더 오히려이 12 μm의 최종 염료 농도의 결과 희석제 C.의 2 배 염료 솔루션을 준비하는 데 사용되는보다 혼합하지 않고 희석제 C의 세포를 배에 직접 추가하지만, 매우 희미하고 이기종 착색을 (준 될 gMFI = 32.9, gCV = 1천20퍼센트). 바로 왜곡 가능성이 가장 높은이의 결합 효과를 반영 관찰 : 나는) 그 불쌍한 널리 서로 다른 전지 및 염료 볼륨으로 인해 혼합을, 및 II) 염료 분배 지점에 가장 가까운 셀이 더보다는 염료의 높은 농도에 노출 될 사실 거리. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 . 다시 3 "SRC ="/ "구경 : 콘텐츠 폭 ="files/ftp_upload/4287/4287fig3.jpg 4.5in "강한 : SRC ="/ files/ftp_upload/4287/4287fig3highres.jpg "/> 그림 3. 생존 프로브를 사용 T 세포 증식 프로파일의 게이팅을 간단하게 hPBMC이 PKH26 (최종 세포 농도 : 3×10 7 / ML, 최종 염료 농도 : 10 μM)으로 표시되었습니다.. 96 앞에서 시간 (자극) 또는 반에는 3 번 CD와 IL-2의 부재 (unstimulated)에 대한 문화 후 세포가 반에는 3 번 CD-FITC, 항 CD19-APC와 7 AAD과 counterstained했고,에 분석 하였다 FACSCalibur 흐름 cytometer (자세한 내용은 참조 13 참조). 색상 보정은 고정 배선 보상 회로를 사용하여 데이터 수집시 수행되었다. ModFit LT3.3에 확산 마법사를 사용하여 4 단계에 설명 된대로 확산의 정도는 모델링되었습니다. PKH26 제외 제어 (표 1, 튜브 7)의 데이터가 참조 (열 3의 회색 가득 histograms)에 중첩됩니다. unstimulated에 대한 Viabilities 및 STImulated 문화 76%과 62 % (패널 ungated 데이터를 A와 B, 각각)했다. 중간에 96 시간을위한 배양 패널 A. PKH26 스테인드 세포가 가능한 (7 AAD 제외)에는 3 번 CD POS 세포를 (R1) 포함 출입을 금지했다. 항체를 포함하고 7 AAD 죽은 세포 제외 게이트뿐만 아니라, 앞으로 분산 (FSC) 대 측 분산은 (SSC) 문은 (R2) 파편과 집계를 제외하는 데 사용되었다. 이 패널의 마지막 음모의 죽은 세포의 부재를 확인합니다. PKH26 확산 프로파일 (열 3) 가장 적합한 모델은 RCS = 2.1 (기부 6, 표 3)를 나타내는 좋은 대칭으로 하나의 피크를 주었고, 부모의 위치를 정의하는 데 사용하고 자극의 분석을 위해 최대 폭을 시작했다 이 데이터 세트 (패널 B)에서 샘플. 패널 B.는 PKH26 스테인드 세포의 복제 나누어지는이 떠있는 최고 위치에있는 A. 모델 패널에서와 같은 방법으로 96 시간 및 개폐에 반에는 3 번 CD와 IL-2와 교양 및 부동 피크 폭주고 RCS = 1.3 (기부 6, 표 3). 패널 C.는 7-AAD 데이터를 사용하지 않고 분석 된 패널과 같은 데이터 파일을 사용하여 해당 데이터에 대한 가장 적합한. 주요 FSC 대 SSC가 부분적으로 죽은 세포 및 집계 (R2)와 3 번 CD 긍정적 인 이벤트를 (R3)을 선택 할 수있는 보조 문을 제외하는 데 사용되었을 때, 죽은 세포의 작은 잔류 인구는 (출입을 금지 사건의 0.2 %) 있었다. 가장 적합한 모델은 (게이트 사건의 1.29 %) 자극 예제에서 죽은 세포의 큰 잔류 인구를 참고 패널 C.에서와 같이 패널에서와 같이 B 출입을 금지했다 RCS = 2.2. 패널 D. 동일한 데이터 파일에 하나의 피크 준 이 게이팅 전략. 가장 적합한 모델은 부동 피크 위치 및 부동 피크 폭 (RCS는 = 1.3)의 하나였습니다. 더 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 . ig4.jpg "강한 : 콘텐츠 폭 ="5in "강한 : SRC ="/ files/ftp_upload/4287/4287fig4highres.jpg "/> 4 그림. fluorochrome 선택과 PKH26으로 표시 immunophenotype의 림프구에 대한 능력 염료 농도의 효과. hPBMC는 24 시간 이전 혈액에서 분리 착색는 12 X 75mm 둥근 바닥으로 수행되었는지를 제외하고, 1 단계의 설명 PKH26와 라벨이 붙지 만 폴리스티렌 튜브보다 12 X 75mm 원뿔 폴리 프로필렌 튜브보다. 즉시 PKH26와 라벨 후, 세포는 지정된 immunophenotypic과 생존 시약과 counterstained, 그리고 그림 3A의 게이팅 전략 다음과 같은 광학 구성하여 LSRFortessa 흐름 cytometer에 분석 하였다 : 488 nm의 레이저 : FSC-A을 (488 nm 정도), SSC – A (10분의 488 BP), FITC-A (30분의 530 BP), PKH26-A (26분의 575 BP), 7-AAD-A 또는 PerCP-A (40분의 695 BP). 640 nm의 레이저 : APC-A 또는 TOPRO-3-A (14분의 670 BP). 색상 보정은 BD 디바 소프트웨어를 사용하여 데이터 수집시 수행되었다. "자동"(패널 C와 D를위한 A와 B, PerCP 패널 APC) 관련 스펙트럼 창에서 노 항체 제어 autofluorescence 나타냅니다. PKH26 제외 제어 (표 1, 튜브 7)의 데이터가 참조 (회색 가득 histograms, 칼럼 (5))에 중첩됩니다. 후 염색의 viabilities는 모든 샘플 (88-92%)에 비슷. 2 μm의 최종 농도에 PKH26으로 표시 패널 A. 셀 안티 – 3 번 CD-FITC, 항 CD4-APC, 7-AAD (를 사용하여 counterstained되었습니다 튜브 표 3의 8). 가능한에 게이팅 (7-AAD 제외)에는 3 번 CD POS의 림프구 (열 1) 파편과 FSC와 SSC (그림 3A 참조)에 따라 집계의 제외하면 PKH26 강도는 APC의 CD4 (열 2, 3)과 함께 평가되었습니다. uncompensated (열 2) 또는 (열 3) 보상 여부,이 fluorochrome 조합) CD4 POS T 세포와 CD4 제외 T 세포 사이 좋은 해상도의 결과 등을 모두 금지에 의해 확인ntibody, autofluorescent 제어 (표 1 관 6, 열 4)과 3 번 CD VS의 2 색 줄거리. CD4 (열 6). 패널 B. 패널에서 동일한 fluorochrome 조합으로 사용하지만, 4 μM의 마지막 PKH26 농도를 증가에 악영향 CD4 제외 T 세포에서 CD4 POS T 세포를 해결 할 수있는 능력에 영향을 미치지 않았다. 패널 C. 독립적으로 2 μm의 최종 농도에 PKH26 라벨이 세포의 복제 나누어지는이 반에는 3 번 CD-FITC, 항 CD4-PerCP 및 TOPRO-3를 사용하여 counterstained되었습니다. 가능한 (TOPRO-3 제외)에는 3 번 CD POS 림프구 (열 1) 파편과 FSC와 SSC (그림 3A 참조)에 따라 집계의 제외에 대한 게이팅 후, PKH26 강도가 반 CD4-PerCP (열 2와 함께 평가되었다 3). PerCP 채널에 PKH26의 상당한 스펙트럼 오버랩은 uncompensated 데이터 (열 2) 분명하고, PKH26 POS의 CD4 사이의 해상도 <su보상 (열 4에 도시 된 노 항체, autofluorescent 제어 칼럼 (3)을 비교) 적용 후 P> POS 및 PKH26 POS의 CD4 제외 이벤트가 한계입니다. 패널 D.는 PKH26 집중은 4 μM로 증가되면 가능한 더 이상 없습니다 PerCP 채널로 PKH26에서 패널 C. 스펙트럼 중복의 fluorochrome 조합을 사용하는 것은 CD4 (열 2) CD4에서 신호의 강도를 초과하는 POS PKH26 POS 이벤트가 더 이상 CD4에서 제외 PKH26 POS T 세포 (칼럼 (3) 해결 할 수 없습니다 VS. 열 4). 더 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 . 그림 5. 에 확산 모델 선택의 영향. 염료 희석 프로파일에 맞는의 선은 hPBMC는 PKH26 (:; 최종 염료 농도 3×10 7 / ML : 10 μM 최종 세포 농도)로 분류되었습니다. 96 앞에서 시간 (자극) 또는 반에는 3 번 CD와 IL-2의 부재 (unstimulated)에 대한 문화 후, 세포가 반에는 3 번 CD-FITC, 항 CD19-APC와 FACSCalibur에 7 AAD 및 분석과 counterstained 수확했다 흐름 cytometer (자세한 방법에 대한 참고 13 참조). 색상 보정은 고정 배선 보상 회로를 사용하여 데이터 수집시 수행되었다. 패널도 3a에 표시되고 ModFit 확산을 제공하기 위해 사용되는. 기부자 5, 중간 응답에 대한 unstimulated 96 시간의 문화에서 PKH26 강도 프로필 출입을 금지했다 . 패널 B 전적인 부모의 셀을 나타내는 피크에 대한 위치와 폭의 첫 번째 추정과 마법사. 병렬에서 PKH26 강도 프로파일을 96 시간 문화를 자극은에서 시작 견적을 사용하여 분석되었다그림과 같이 연속 딸 세대를위한 패널과 4 고정 또는 부동 최고 농도에 해당하는 '확산 마법사'설정의 다른 조합, 그리고 고정 또는 부동 피크 폭을. 으로 표 3, 관측 데이터에 가장 적합한 준 모델에 요약 (최저 감소 치 평방, RCS) 정상 위치뿐만 아니라 딸이 생성 봉우리 표준 편차뿐만 아니라 허용 된에서 "부동 / 유동"조합했습니다 다양합니다 (RCS = 1.5). 같은 모델은 기부자 6, 높은 응답 (그림 3B 및 표 3)에 대한 가장 적합한했다. 6 그림. 두 번째 셀 추적 염료의 추가는 유동 cytometric 억제 분석에 효과기 및 규제 T 세포 사이의 차별을 단순화. TRIMA leukapheresis 필터에 준비 단핵 세포 – 고갈 림프구가 안티 CD127-PE, 항 CD4-PE-Cy7 물들되었다 (. 18 참조에서 적응), 및 안티 CD25-APC와 흐름 이펙터 (Teff의 인구로 분류, CD4 POS CD127 밝은 CD25 흐린), 규제 (Treg, CD4 POS CD127 희미 CD25 POS) 및 액세서리 (CD4 제외) 세포. CFSE (최종 세포 농도 : 5 × 10 7 / ML, 최종 염료 농도, 5 μM)로 표시하고 정렬 Teff :; CellVue 피 (1 μM 최종 염료 농도 1×10 6 / ML 최종 세포 농도)로 표시된 정렬 Treg 세포였다 반에는 3 번 CD, 항 CD28 및 방사능 액세서리 세포의 존재에 비율을 변화에 공동 배양 하였다. 96 시간 후, 문화가 수확 된, 항 CD4-PE-Cy7 죽은 / LIVE 고칠 누나와 함께 counterstained, 그리고 LSRII 흐름 cytometer 및 색상 보정을 분석의 데이터 acquisitio시 수행 된N BD 디바 소프트웨어 (보상 제어 등의 자세한 내용은 참조 18 참조)를 사용하여. 4 단계에 설명 된대로 Teff와 Treg의 확산 지수는 ModFit LT3.3에 확산 마법사를 사용하여 모델링되었다. 패널 B와 C의 데이터 요소는 세중의 샘플의 평균 ± 1 표준 편차를 나타냅니다 패널 A. 대표 데이터가 Treg 세명 세중의 샘플 중 하나에 표시됩니다 :. 0.25:1의 Teff 비율입니다. 다른 모든 데이터 플롯에서, LIVE / 죽었 고칠 보라 시약은 죽은 세포 (= 붉은 갈색, nonviable Teff = 회색 nonviable Treg = 붉은 색 액세서리 세포 R1, 왼쪽 상단 줄거리)을 제외하는 데 사용되었다. CellVue 피에 착색이 가능한 Treg을 (R4, 가운데 오른쪽 줄거리, 파란색) 구별하는 데 사용 가능한뿐 아니라 매우 Teff을 (R5, 가운데 오른쪽 줄거리, 녹색) 확산. Teff (왼쪽 아래 플롯)에 대한 하나의 매개 변수 CFSE 확산 프로필이 CFSE POS (R5), 실용적 CD4 POS (R3), (하지 R1)이었다 세포에 게이팅에 의해 생성하고, 림프구 SC가 생겼 대요atter 서비스 (R2). Treg을위한 하나의 매개 변수 CellVue의 피 확산 프로필이 CellVue 피 POS (R4), 실용적 CD4 POS (R3), (하지 R1)이었다 세포에 게이팅에 의해 생성하고, 림프구 분산 속성 (R2)를 가지고했습니다. 림프구 폭발을 포함하도록 정의 된 관대 한 림프구 지역 (R2)를합니다. 수집 할 셀의 총 관심의 가장 낮은 주파수 인구에 따라 달라집니다 수도 있습니다. 관심 인구가 7 ~ 8 세대 셀의 다수의 최대 나타내는 농도의 넓은 범위에 걸쳐 분산 될 수있는 세포 증식 실험에서 정확하게 모델링하고 각 세대에있는 셀의 개수를 계산하기 위해 수집해야합니다. 희귀 한 세포를 연구 할 때, 단순히 이벤트의 최대 수를 수집하기 위해 거의 건조 샘플 튜브를 실행해야 할 수도 있습니다. 샘플 여기에 표시를 들어,이 일을하면 11923이 Teff 된 중 ~ 25000 이벤트 (확산 I의 총 결과ndex 3.85)과 1380은 Treg (확산 지수 1.83)이었다. 패널 B. 예상대로, Teff의 세포 증식의 큰 억제으로 이어 공동 문화에 Tregs 존재의 비율을 증가합니다. 비슷한 결과가 효력을 Treg에 영향을주지 않은 CellVue 피 추적 염료와의 착색을 나타내는 CellVue 피 묻은 (실선) 또는 흠없는 (점선) Treg 모두 획득했다. 패널 C. Treg이 예상대로 상대적으로 anergic하고, 한 Teff 세포의 부재 (: 1시의 Teff 비율 Treg)의 반에는 3 번 CD, 항 CD28 및 액세서리 세포와 incubated 때 세포 분열 따위에 의해 번식 수 없습니다. 그러나, 공동 문화에 Teff 존재하는 비율 (즉, Treg 등 : Teff 비율이 감소) 증가, Treg 확산의 범위도 증가했다. 적어도 부분에서 이러한 데이터에 대한 일반적으로 큰 오차 막대는 불확실 Teff를 기준으로하고 더 수집 이벤트의 작은 숫자로 이어지는 확산의 제한된 범위를 반영각 세대에 세포의 수를 모델링에 타이. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 . 튜브 번호 (목적) PKH26 항체 (이거 야) 7-AAD 1 (설정, 보상) – – – 2 (설치, 보상) + – – 3 (설치, 보상) – – + 4 (보상) – CD8-FITC B – 5 (보상) – CD8-APC B – 6 (없음 AB 제어) + – + 7 (없음 추적 염료 죄수trol) – 3 번 CD-FITC CD4-APC 또는 CD19-APC C + 8 (T0 제어) + 3 번 CD-FITC CD4-APC 또는 CD19-APC C + . 표 1 악기 설정을 조정을 사용하여 4 색 CD4 T 세포 증식 모니터링 분석에 적합한 나열된 컨트롤 :. PKH26 (확산 염료), 3 번 CD-FITC (팬-T 세포의 마커), CD4-APC (T-도우미 세포 마커), 7 aminoactinomycin D (7 AAD, 죽은 세포 제외) 나 3 번 CD-FITC와 CD4-APC에 대한 밝은 surrogates (보상 오류를 감지하는 가장 좋은 능력) C 그림 3 :.. 3 번 CD-FITC와 CD19-APC. D 그림 4 : 3 번 CD-FITC와 CD4-APC. 셀 유형 최종 세포 농도 최종 염료 농도 </strong>을 참고 hPBMC B 1 개 10 7 / ML 2 μM PKH67 10,17 5 × 10 6 / ML 2 μM PKH26 12 3 × 10 7 / ML 10 μM PKH26 13 5 × 10 7 / ML 30 μM PKH26 18 1 × 10 6 / ML 1 μM의 CellVue의 피 C 18 3 × 10 7 / ML 4 μM C​​ellVue의 피 13 5 × 10 7 / ML 5 μM C​​ellVue의 피 18 문화의 셀 5 × 10 5 / ML 0.1 μM PKH26 (1 ° 유방 세포) 8 1 개 10 7 / ML 15 μM PKH26 (U937) 18 1 개 10 7 / ML 12.5 -15 μM PKH26 (U937) 15 1 개 10 7 / ML 1 μM PKH67 (K562) 18 1 개 10 7 / ML 1 μM PKH67 (T 세포 라인) 9 1 개 10 7 / ML 10 μM의 CellVue의 피 (냑-1) 23 표 2. 비 Perturbing 막 염료의 염색 조건. 적응 및 참조 업데이트 될 수 있습니다. 18. B 저속 세척 (300 XG)이 혈소판 오염을 최소화하기 위해 사용되었습니다. C Treg 세포는 (흐름 정렬 CD4 POS POS CD25 CD127 제외의 림프구). 모델 설정 <td cols팬 = "6"> 모델 결과 기증자 치료 피크 위치 SD 부모 위치 부모 SD # 봉우리의 마감 RCS PI PF 5 Unstimulated 뜨다 뜨다 209 4.5 1 5.1 1.0 0 5 자극 고정 고정 209 <td> 4.5 7 35 3.9 31 5 자극 뜨다 고정 209 4.5 8 19 4.3 30 5 자극 고정 뜨다 209 9.2 6 1.9 3.8 30 5 자극 뜨다 뜨다 209 9.0 7 1.5 3.7 29 6 Unstimulated 뜨다 뜨다 205 4.0 1 2.1 1.0 0 6 자극 고정 고정 205 4.0 6 42 6.6 60 6 </td> 자극 뜨다 고정 205 4.0 7 12 7.4 60 6 자극 고정 뜨다 205 8.6 6 6.9 6.8 62 6 자극 뜨다 뜨다 205 6.5 6 1.3 6.5 59 표 3. 맞춤의 신 이여 (RCS) 및 확산 통계 그림 3A & B에 설명 된대로. 샘플 염색, 데이터 수집 및 게이팅에 확산 모델의 영향.