細胞トラッキング染料を使用して細胞分裂監視のための最適化された染色と増殖モデリング方法

PKH26のような膜色素は細胞膜にはなく、化学反応（CFSE）または平衡結合（抗体）によってほぼ瞬時パーティショニングによって染色。 図1に概説重要な問題への関心の欠如は、 図2に示されたタイプの薄暗いまたは異種染色をもたらすかもしれません。対照的に、最適化された標識条件の使用（ 図1、表2）色素希釈（ 図3）に基づいて、細胞分裂の監視を含む、細胞追跡、様々なアプリケーションに適した明るい均質分布における結果。死んだ/死にかけている細胞が拡大および/ ​​またはスキュー娘世代強度と色素希釈3,4,16,18に基づく拡散モデルを複雑にする可能性がある染料を追跡するための様々な量を失う。死んだ細胞のかなりの数が事前にすることができる条件下で色素希釈データを収集する場合に生存率色素の使用が推奨されるそのような刺激された培養物（ 図3）またはそれ以前の試料（ 図4）のように、送信されます。 トラッキング色素標識は、典型的には蛍光強度の免疫表現より数桁大きいを与えるので、それは適切な補償制御します（ 表1）を含むようにし、トラッキング色素の存在が抗体陽性と陰性細胞（ 図解決する能力を損なうことがないことを検証することが重要です4）過剰な色補正の必要性を回避するためには、明るい蛍光色素を配置することが望ましい、またはトラッキング色素に隣接するスペクトルチャネル（複数可）には、このような生きた細胞で除外染料として、目的の細胞には見られない1 （ 図4A＆B 対 。4C＆D）増殖の程度を定量化するためにピークモデリングソフトウェアを使用する場合は、良好なフィット感を得ることは色素希釈のprofの特性にモデル内でマッチング仮定を必要と（ 図5、表3）分析される諸島。トラッキング染料および生存率の試薬の適切なオプションを選択すると、それは、同時に複数のリンパ球亜集団で増殖応答を特徴づけることも可能です。 図6に示すように、たとえば、第二のトラッキング色素の添加は、制御性T細胞（CellVueクラレットで標識）と非常に増殖し、エフェクターT細胞（CFSEで標識）との間に差別を簡素化し、得られるよりも、それらの相互作用についてのはるかに詳細を提供しています3 H-チミジン標識18,27を使用しています 。 図1。 PKH26、PKH67とCellVue染料のための一般的なメンブレン標識プロトコールは 、細胞体肢にこれらの非常に親油性染料の分配NEは、染色は染料溶解性および染色効率を最大化するために設けられて無塩の希釈液Cの車両で実施される細胞と混合すると瞬時に本質的に発生します。 PKH26で一般膜標識のためにこの回路図にまとめられているように、明るく、均一で再現性のある染色は、したがって、最も簡単にすることによって得られる：1）を保証する混合技術を使用して）染色工程および2に存在するタンパク質および/またはその塩の量を最小限に抑える色素の細胞の急速な均質分散（ すなわち 、同時に染料の同じ濃度になるようにすべてのセルを公開しています）。 図2。 PKH26蛍光分布 （文献から転載。18） の条件を染色の効果が。対数的に成長し、培養したUのサンプルを複製染料を2倍に2倍の細胞の添加時に即時混合の有無にかかわらず、周囲温度で3分間- ：937細胞はPKH26（15μMPKH26 1×10 7細胞/ ml、12最終濃度）で染色した。洗浄した後、染色された細胞は、一定の測定器の設定を使用して、ベックマン·コールター社シアンフローサイトメーターで解析したヒストグラム1：最初のチャネルに蓄積なし/少数の細胞を用いて最初の十年のスケール上のすべてのセルを配置するように調整PKH26検出器電圧で染色されていないコントロール。 ヒストグラム2：即時混合しながら染料を2倍の2倍の細胞の添加を使用して、15μMの染料で染色が少ない/最後のチャネルに蓄積ない細胞（gMFI =で、明るく、均一に染色された、第四十年間に置かれた細胞の対称的な人口をもたらし2548年、GCV = 26.2％） ヒストグラム3：染料を2倍の2倍細胞の添加を使用して、15μMの染料で染色が、即時の混合なし低減強度とより広範なCV（gMFI = 505の結果 、GCV = 116％）と同様に、管の壁ではなく、2倍の染料溶液に分注し、細胞の低下が原因の可能性薄暗くステンド亜集団、 ヒストグラム4：濃縮されたエタノール染料を3μlにつながっ染色エラー在庫はさらにこの1210μMの最終色素濃度をもたらしたが、非常に暗く、異種染色（gMFI = 32.9、GCVたを混合ではなく、希釈液Cで2倍の色素溶液を調製するのに使用されることなく、希釈液Cでセルを2倍速に直接追加さ= 1020％）。観察右スキュー最も可能性が高いの複合効果反映します：i）貧困層が広く、異種細胞と色素のボリュームに起因する混合する工程;染料調剤ポイントに最も近いセルが遠いものよりも染料のより高い濃度にさらされるであろうという事実を、及びii）離れて。 拡大図を表示するにはここをクリック 。 RE 3は "src =" / "FO：コンテンツの幅=" files/ftp_upload/4287/4287fig3.jpg 4.5in "のfo：SRC =" / files/ftp_upload/4287/4287fig3highres.jpg "/> 図3。生存率プローブを使用することにより、T細胞増殖プロファイルのゲーティングを簡素 hPBMCがPKH26（最終細胞濃度：3×10 7 / mlに、最終色素濃度：10μM）で標識した。抗CD3およびIL-2の存在下で96時間（刺激）または非存在下（刺激されていない）の培養後、細胞を抗CD3-FITC、抗CD19-APCと7-AADで対比染色した、と分析した上でFACSCaliburフローサイトメーター（詳細については、リファレンス13を参照）。色補正はハードワイヤード補償回路を使用して、データ取得時に行った。 ModFit LT3.3で増殖ウィザードを使用して、ステップ4で説明したように増殖の程度をモデル化した。 PKH26 ネガティブコントロール（ 表1、チューブ7）からのデータを参照（3列目のグレー埋めヒストグラム）のためにオーバーレイされます。刺激されていないための生存とSTImulated文化は76％、62％（パネル用ゲートなしデータとB、それぞれ）であった。培地中で96時間培養パネルA. PKH26染色された細胞は、生存（7-AAD NEG）CD3 POS細胞（R1）を含めるようにしてゲートをかけた。抗体包含と7-AADの死細胞の排除ゲート、前方散乱（FSC）の対側方散乱光（SSC）に加えて、ゲート（R2）は、破片や集計を除外するために使用されていました。このパネルの最後のプロットで死んだ細胞が存在しないことに注意してください。 PKH26増殖プロファイル（列3）のベストフィットモデルは、RCS = 2.1（ドナー6、 表3）を示す良好な対称性を持つ単一のピークを与え、親の位置を定義するために使用すると刺激の分析のためにピーク幅を開始しましたこのデータセット（パネルB）からのサンプル。 パネルB. PKH26染色された細胞の複製アリコートはフローティングピーク位置をもつモデルパネルAと同様にして96時間とgatedの抗CD3およびIL-2と培養したと浮動ピーク幅が与え RCS = 1.3（ドナー6、 表3）。パネルC. 7-AADのデータを使用せずに分析したパネルと同じデータファイルを使用してこのデータに最適。プライマリーFSC対SSCが部分的に死んだ細胞と骨材（R2）とCD3陽性イベント（R3）を選択するための二次的なゲートを除外するために使用されたとき、死んだ細胞の小さな残留人口は（ゲートイベントの0.2％）であった。ベストフィットモデル（ゲートイベントの1.29％）、刺激し、試料中の死細胞の大きな残留人口をメモパネルCと同じようにパネルのようにBがゲートだったRCS = 2.2。 パネルD.同じデータファイルを使用して単一のピークを与えたこのゲーティング戦略の。ベストフィットモデルはフローティングピーク位置と浮動ピーク幅（RCS = 1.3）を持つものだった。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。 ig4.jpg "のfo：コンテンツの幅=" 5インチ "のfo：SRC =" / files/ftp_upload/4287/4287fig4highres.jpg "/> 図4。 PKH26で標識免疫表現型リンパ球への能力に蛍光色素の選択と色素濃度の影響。hPBMCは24時間古い血液から分離され、ステップ1で説明したように染色は12×75mmの丸底で行われたことを除いて、PKH26で標識したポリスチレンチューブではなく、12 x 75 mmの円錐形のポリプロピレンチューブ。直ちにPKH26で標識した後、細胞を、示さ免疫表現型と生存率の試薬 ​​を用いて対比し、 図3Aのゲーティング戦略と次の光学構成を使用してLSRFortessaフローサイトメーター上で分析した：488nmのレーザー：FSC-Aを（488 nm）を、SSC – （10分の488 BP）は、FITC-A（30分の530 BP）; PKH26-（26分の575 BP）、7-AAD-またはも、PerCP-A（40分の695 BP）。 640 nmのレーザー：APC-AまたはTOPRO -3 – （14分の670 BP）。色補正は、BD歌姫ソフトウェアを使用してデータ収集の時点で行った。 "オート"関連するスペクトル窓における無抗体コントロール（パネルAおよびB、パネルCおよびDのPerCPについては、APC）の自家蛍光を示しています。 PKH26 ネガティブコントロール（ 表1、チューブ7）からのデータは、参照（グレー埋めヒストグラム、カラム5）のためにオーバーレイされます。後染色生存率は、すべてのサンプル（88から92パーセント）に類似していた。2μMの最終濃度でPKH26で標識されたパネルA.細胞は抗CD3-FITC、抗CD4-APCと,7-AAD（を使用して染色したチューブ表3の8）。実行可能な（7-AAD NEG）CD3 posのリンパ球（列1）及びFSCおよびSSCに基づいて、破片や骨材の排除に関するゲーティング（ 図3Aを参照）した後、PKH26強度はAPC CD4（2列目と3列目）と組み合わせて評価した。補償されていない（コラム2）または（3列目）を補償するかどうか、この色素の組み合わせ）は、CD4 POS T細胞およびCD4 NEG T細胞との間の良好な解像度が得られ、両方として無によって検証ntibody、自家蛍光コントロール（ 表1のチューブ6; 4列）とCD3 対の2色プロット。 CD4（コラム6）。 パネルB。パネルで同じ蛍光色素の組み合わせをとして使用しますが、4μMの最終PKH26濃度を増加させるに悪影響CD4 NEG T細胞からCD4 POS T細胞を解決する能力に影響を与えなかった。 パネルC.独立して最終濃度2μMでPKH26で標識された細胞の複製アリコートを抗CD3-FITC、抗CD4-PerCP、およびTOPRO-3を用いて対比染色した。実行可能な（TOPRO-3 NEG）CD3 posのリンパ球（列1）及びFSCおよびSSCに基づいて破片や骨材の排除に関するゲーティング（ 図3Aを参照）した後、PKH26強度は抗CD4-PerCP（柱2との組み合わせで評価したと3）。 PerCPチャネルへPKH26の実質的なスペクトルの重なりは、補償されていないデータ（列2）、およびPKH26 posの CD4間の分解能で明らかである<sup> posとPKH26 posの CD4補償は（カラム4に示すように、無抗体、自家コントロールと3列目を比較して）適用された後NEGイベントが限界です。 パネルD. PKH26濃度は4μMまで増加させると、それが実行できなくなりますPerCPチャンネルはCD4（2列目）とCD4からの信号の強度を超えるにPOS PKH26 posが PKH26からパネルC.スペクトルの重なりの蛍光色素の組み合わせを使用するイベントは、CD4 NEG PKH26 POS T細胞（3列目から解決することはできなくなりました対 4列）。 拡大図を表示するにはここをクリック 。 図5。上の増殖モデル選択の効果。色素希釈プロファイルの適合度hPBMCはPKH26（：;最終色素濃度3×10 7 / mlの：10μMの最終細胞濃度）で標識した。抗CD3およびIL-2の存在下（刺激）または非存在下（刺激されていない）で96時間培養後、細胞を抗CD3-FITC、抗CD19-APCと7-AADで対比したFACSCaliburで分析収穫したフローサイトメーター（詳細な方法のためのリファレンス13を参照）。色補正はハードワイヤード補償回路を使用して、データ取得時に行われた。 パネルが 。ドナー5、適度な応答のための刺激を受けていない96時間培養からPKH26強度プロファイルは、図3Aに示すように、ゲート付きだったとModFit増殖を提供するために使用。 パネルB分割されていない親細胞を表すピークの位置と幅の最初の見積もりとウィザード。パラレルからPKH26強度プロファイルは、96時間培養を刺激してから出発して推定値を用いて分析した図のように連続した娘の世代のためのパネルと4つの固定または浮動ピーク強度に対応した "増殖ウィザード"設定の組み合わせ、および固定または浮動ピーク幅を。 表3にまとめたように、観測データ（カイ二乗最小減少; RCS）にベストフィットを与えたモデルでは、ピークの位置だけではなくなる"浮動/フローティング"の組み合わせでしたが、また娘世代のピークの標準偏差は許されていた（RCS = 1.5）を変化させることができる。同じモデルは、ドナー6、高応答（ 図3Bおよび表3）のための最高のフィット感を与えました。 図6。第二のセルトラッキング色素の添加は、フローサイトメトリー抑制アッセイでエフェクターと制御性T細胞との間の差別を簡素化。TRIMA白血球搬出フィルターから調製した単球枯渇したリンパ球を抗CD127-PE、抗CD4-PE-Cy7で染色した（図18文献から適応）、および抗CD25-APCと流れはエフェクター（テフの集団に分類; CD4 POS CD127 明るい CD25 dim）は、規制（Tregは、CD4 + CD25 POS CD127 薄暗いPOS）、および付属品（CD4 NEG）細胞。 CFSE（最終細胞濃度5×10 7 / mlに、最後の染料濃度5μM）で標識し、ソートテフ：;：CellVueクラレット（1μM最終色素濃度1×10 6 / mlの最終細胞濃度）で標識されたソートTreg細胞であった抗CD3、抗CD28および照射アクセサリー細胞の存在下で様々な比率で共培養した。データacquisitio時に行われた96時間後、培養物を、収穫した抗CD4-PE-Cy7及びLIVE / DEAD修正可能なバイオレットで対比し、LSRIIフローサイトメーターと色補正で分析nは、BD DIVAソフトウェア（補償制御などの詳細は文​​献18を参照）を使用。ステップ4で説明したようにテフとTreg細胞用増殖指数はModFit LT3.3の増殖·ウィザードを使用して、モデル化した。パネルB及びCのデータポイントは、三連の試料の平均±1標準偏差を表すパネルA.描写データはTreg細胞における3三連の試料の1のために示されている。0.25:1のテフ比。他のすべてのデータのプロットから、LIVE / DEAD修正可能バイオレット試薬は死んだ細胞（=赤茶色、生き残れないテフ=グレーと生育不能なTreg =赤のアクセサリー細胞、R1、左上のプロット）を除外するために使用された。 CellVueクラレット染色は、実行可能なTreg細胞（R4、中央右のプロット;青）を区別するために使用されていたからではなく、非常に現実的なテフ（R5、中央右のプロット;緑色）を増殖した。テフ（左下のプロット）のパラメータが1つのCFSE増殖プロファイルはCFSE POS（R5）は、CD4 + POS（R3）は、実行可能な（ないR1）があった細胞にゲートによって生成され、リンパ球SCを持っていたatterプロパティ（R2）。 Tregのための単一のパラメータCellVueクラレット増殖プロファイルはCellVueクラレットPOS（R4）は、実行可能なCD4 + POS（R3）は、（ないR1）があった細胞のゲーティングによって生成され、リンパ球の散乱特性（R2）を有していた。リンパ芽球を含むように定義寛大なリンパ球領域（R2）を注意してください。収集される細胞の総数が対象となる最低周波数の人口に依存することにも注意してください。興味のある人口は7または8世代多数のセルまで表す強度の広い範囲にわたって分散させることができる細胞増殖実験で正確にモデリングし、各世代のセルの数を計算するために収集する必要があります。希少な細胞を研究するとき、それは単にイベントの最大数を可能な限り収集するために、ほぼ乾燥試料管を実行するために必要であるかもしれません。ここに示されているサンプルについては、これを行うと、11923はテフ（拡散私そのうち〜25,000イベントの合計をもたらしINDEX索引3.85）と1380は、Treg細胞（増殖指数1.83）であった。 パネルB.期待されるように、テフ細胞増殖の大きい抑制につながった共培養におけるTregsの存在の割合を増やす。同様の結果がCellVueクラレットトラッキング色素とその染色は効力をTreg細胞には影響しなかったことを示す、クラレット染色しCellVue（ 実線 ）または未染色（ 破線 ）Tregの両方で得られた。 パネルC. Treg細胞は、予想通り、でした比較的アネルギーあり、 Teff細胞の非存在下（：1:0のテフ比Treg細胞）における抗CD3、抗CD28、およびアクセサリー細胞とともにインキュベートしたときに増殖しない。しかし、共培養におけるテフ存在する割合（ すなわち 、Treg細胞のように：テフ比は減少）増加し、Treg細胞増殖の程度も増加した。少なくとも部分的には、これらのデータのために一般的に大きなエラーバーは、不確実なテフに対して相対的と大きい収集されたイベントの小さい数字につながる、増殖の限られた範囲を反映各世代で細胞数のモデリングにtyは。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。 チューブ号（目的） PKH26 抗体（IES） 7-AAD 1（セットアップ、補償​​） – – – 2（セットアップ、補償​​） + – – 3（セットアップ、補償​​） – – + 4（補償） – CD8-FITC B – 5（補償） – CD8-APC B – 6（無Abの制御） + – + 7（無トラッキング色素詐欺TROL） – CD3-FITC CD4-APC または CD19-APC C + 8（T0制御） + CD3-FITC CD4-APC または CD19-APC C + 表1機器設定を制御します記載されているコントロールを使用して4色のCD4 T細胞の増殖をモニタリングアッセイに適しています。PKH26（増殖色素）、CD3-FITC（汎T細胞マーカー）、CD4-APC（T-ヘルパー細胞マーカー）、7 aminoactinomycin D（7-AAD、死細胞の排除）B CD3-FITCおよびCD4-APC（補償エラーを検出するためのより良い能力）の明るいサロゲートC 図3：CD3-FITCおよびCD19-APC。 D 図 4：CD3-FITCおよびCD4-APC。 細胞型 最終細胞濃度 ファイナル色素濃度</強い> リファレンス hPBMC B 1×10 7 / mlの 2μMのPKH67 10,17 5×10 6個 / ml 2μMのPKH26 12 3×10 7 / mlの 10μMのPKH26 13 5×10 7 / mlの 30μMのPKH26 18 1×10 6個 / ml 1μMのCellVueクラレットC 18 3×10 7 / mlの 4μMのCellVueクラレット 13 5×10 7 / mlの 5μMのCellVueクラレット 18 培養中の細胞 5×10 5 / mlの 0.1μMのPKH26（1°乳腺細胞） 8 1×10 7 / mlの 15μMのPKH26（U937） 18 1×10 7 / mlの 12.5 -15μMPKH26（U937） 15 1×10 7 / mlの 1μMのPKH67（K562） 18 1×10 7 / mlの 1μMのPKH67（T細胞株） 9 1×10 7 / mlの 10μMのCellVueクラレット（YAC-1） 23 表2非摂動膜-色素染色条件。適応とRefから更新。 18 B低速ウォッシュ（300 XG）は血小板汚染を最小限にするために使用されていました。C Treg細胞は、（フローソートされたCD4 POS CD25 CD127 POS NEGリンパ球）。 モデル設定 <td colsパン= "6"> モデル結果 ドナー 治療 ピーク位置 SD 親の位置 親のSD ＃ピークスの装着 RCS PI PF 5 刺激されないフロートフロート 209 4.5 1 5.1 1.0 0 5 刺激を受けた固定した固定した 209 <td> 4.5 7 35 3.9 31 5 刺激を受けたフロート固定した 209 4.5 8 19 4.3 30 5 刺激を受けた固定したフロート 209 9.2 6 1.9 3.8 30 5 刺激を受けたフロートフロート 209 9.0 7 1.5 3.7 29 6 刺激されないフロートフロート 205 4.0 1 2.1 1.0 0 6 刺激を受けた固定した固定した 205 4.0 6 42 6.6 60 6 </td> 刺激を受けたフロート固定した 205 4.0 7 12 7.4 60 6 刺激を受けた固定したフロート 205 8.6 6 6.9 6.8 62 6 刺激を受けたフロートフロート 205 6.5 6 1.3 6.5 59 表3。適合度（RCS）と増殖メトリック図3AおよびBで説明される。サンプル染色、データ収集およびゲーティングで拡散モデルの影響。