בידוד מהיר של נספח אווירי בתאי הגידול במחזור של דגימות דם החולה

פרוטוקול הבאה היא לייצור מכשיר microtube אחת. 1. הכנת פתרון Nanotube Halloysite Sonicate (10-13 וואט (RMS)) 250 halloysite μL Nanotube פתרון (6.6% WT במים) 30 שניות. פתרון מגניב עם מים קרים sonication חוזרת פעם אחת. מצננים שוב. צייר פתרון sonicated לתוך מזרק, חבר 0.45 מזרק מסנן מיקרומטר, והפתרון המסנן לתוך צינור microfuge נקי. הפתרון וורטקס מדי פעם כדי לשמור על אחידות. 2. ציפוי של משטח Microtube פנימית עם צינורות halloysite קבל 50 ס"מ בחלק הארוך של microtubing מיקרו Renathane (300 מיקרומטר קוטר פנימי, 35.3 נפח פנימי μL). חותכים קצה אחד של microtube ב באלכסון ולהכניס לתוך חתיכת IDEX מתאם קטן. הכנס את המחט של המזרק 29G 3/10 סמ"ק אל הקצה השני של microtube. כדי לנקות את microtube, מקם את הקצה הפתוח של microtube (סוףעם מתאם) אתנול 70% ולצייר ~ 50 אתנול μL לתוך המזרק למלא microtube. שוטפים את אתנול מתוך microtube על ידי ציור נפח נדיב של מים מזוקקים לתוך המזרק. לנתק את המזרק מ microtube, לרוקן את המזרק, ואז לצרף את microtube. להכין תמיסה של 0.02% w / v פולי-L ליזין במים. צייר 50 μL אל microtube ולאפשר לשבת 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT). צייר 100 Nanotube μL פתרון הסתנן אל microtube ולאפשר כדי לדגור על 3 דק 'ב RT. צייר 100 מים μL דרך microtube לשטוף את הפתרון Nanotube. אפשר microtube מצופה לשבת, מלא מים, למשך הלילה בבית RT. 3. הכנת Microtubes על בידוד תא להכין תמיסה של 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​חלבון G ב פוספט 1X של Dulbecco בופר סליין (PBS, pH 7.0-7.2). צייר 50 PBS μL דרך microtube ואז לצייר 50 μL שלהפתרון חלבון G ולאפשר כדי לדגור על 1.5 שעות ב RT. להכין תמיסה המכילה 5 מיקרוגרם / מ"ל ​​E-selectin-IgG ו – 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​נוגדנים (אנטי EpCAM עבור דגימות סרטן רוב, אנטי PSMA עבור דגימות סרטן הערמונית) ב PBS. צייר 50 μL של selectin-E פתרון נוגדנים לתוך microtube ולאפשר כדי לדגור על משאבי אנוש 2 ב RT. הידבקות הסלולר ספציפי חסום עם חלבון חלב 5%. הכן את הפתרון של 5% (w / v) חלבון חלב PBS. צייר 50 הפתרון μL חלבון החלב לתוך microtube ולאפשר כדי לדגור על שעות 1 ב RT. צייר 50 PBS μL לתוך הצינור ולהשאיר על RT עד דם או באפי דגימות המעיל מוכנים לעיבוד. 10 דקות לפני השימוש microtube לבידוד, צייר 50 PBS μL כי כבר רווי Ca 2 + ("PBS +") כדי להפעיל את מולקולות selectin. 4. הכנת דגימות לבידוד בתא צייר או להשיג 10 מ"ל דם מחולה לתוך heparinizedצינור. מקום 10 מ"ל Ficoll-Paque פתרון לימפוציטים הבידוד לתוך צינור 50 צנטריפוגות מ"ל. בעדינות 10 מ"ל שכבת הדם כולו על גבי Ficoll כדי לא לערבב את הדם Ficoll. צנטריפוגה ב 2000x גרם במשך 15 דקות על 4 מעלות צלזיוס עם האטה מינימלית. להסיר את שכבת מעיל באפי ומכניסים צינור חדש. לשטוף באפי מעיל עם PBS (צנטריפוגות ב 230x גרם דקות 10, לבטל את supernatant). בעדינות resuspend תאים עם חיץ 1 תמוגה RBC מ"ל ו דגירה של 10 דקות על RT כדי lyse אריתרוציטים. הוסף 10 מ"ל PBS, מערבבים בעדינות, צנטריפוגות ב 230x גרם ל 10 דקות. מחק supernatant בעדינות resuspend גלולה ב 3-4 מ"ל PBS +. 5. תא בידוד צרף קצה אחד של microtube פונקציונליות כדי מזרק 5 מ"ל באמצעות מתאמי IDEX. הכנס את המזרק לתוך משאבת מזרק. להטביע את הקצה הפתוח של microtube פונקציונליות לתוך התא suspension. תהליך ההשעיה התא דרך microtube ב 1-4 מ"ל / h. מעבירים את הקצה הפתוח של microtube כדי צינור המכיל PBS + ולצייר 300 μL + PBS לתוך המזרק על 0.016 מ"ל / דקה להסיר מאוגד ותאי המרופט מ microtube. מניחים את הקצה הפתוח של microtube לתוך צינור נקי. נתק את המזרק מ microtube ולצרף מזרק עם Accutase. בעדינות perfuse Accutase מספיק לתוך microtube למלא (~ 50 μL) ולאפשר כדי לדגור על RT במשך 10 דקות. צרף מזרק עם 1 מ"ל של התקשורת הצמיחה (79% RPMI, FBS 20%, 1% סטרפטומיצין פניצילין) ו perfuse אל microtube, איסוף שפכים לתוך התרבות רקמת יחס טוב צלחת. תאים תרבות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 בתנאים humidified. 6. נציג תוצאות מטרת טכניקה זו היא לבודד את התאים הסרטניים קיימא מדם של חולי סרטן. קיימים מספר שיטות לזיהוי תאים סרטניים בתרבית, אימות הכרחי להצלחת המכשיר. בחרנו כתם התאים בתרבית עם נוגדנים נגד moieties אפיתל כמו EpCAM (הידבקות אפיתל מולקולה תאית) או PSMA (אנטיגן ספציפי לערמונית קרום), בנוסף DAPI לזהות גרעיני תאים שלמים (איור 2 ו 3). מספר תאים סרטניים שנתפסו באמצעות טכניקה זו היא בהכרח פונקציה של מספר CTCs במדגם ההתחלה וכי השונות המטופל יכול להיות גבוה. בעיבוד דגימות שנלקחו מהחולים שאובחנו עם סרטן בשלב IV, אנחנו באופן שגרתי ללכוד בין 100 ל 500 תאים סרטניים בכל צינור של דם, על purities> 50%. מיד לאחר הבידוד, מספר גדול יותר של כדוריות דם לבנות מזהמים יכולים להיות נוכחים. עם זאת המספרים הללו ייגמרו הדגירה הבאה במדיום התרבות של עד 5 ימים. <strong> באיור 1. סכמטי של microtube פונקציונליות עבור בידוד CTC, מראה selectin בתיווך מתגלגל אחריו הידבקות נוגדנים בתיווך סטטי. איור 2. נתונים מייצגים של בידוד CTC של דגימות דם נמשך מחולה סרטן השד חולת סרטן ריאות. מספר תאים קיימא המזוהים באופן חיובי כמו CTC מבוסס על מכתים EpCAM מיוצג על ידי מוטות מוצקים מתייחסים לתאם שמאל אחוז תאים שזוהו כמו CTC בהשוואה למספר הכולל של תאים שנכבשו מיוצג על ידי הברים פתוחים נמדד על לתאם הנכון. התוצאות לאחר חמישה ימים בתרבות. באיור 3. נציג micrographs מתורמים שונים (A ו-B) של CTC בתרבות 5 יום ממועד isolatiעל פי מדגם החולה בסרטן הדם. התאים היו מוכתמות fluorescently עם AlexaFluor 488 (ירוק) ו 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) עבור EpCAM לדמיין את הגרעין (כחול).