Un test per la valutazione dei comportamenti Espianto cellulare del Mesenchima cranio

1. Preparazione di piatti Cultura ECM rivestiti o coprioggetto Preparare soluzione di ECM sciogliendo substrato ECM in PBS (Dulbecco Phosphate-Buffered Saline, Invitrogen, # 14040-133). Filtrare con un filtro a siringa 0,2 millimetri (VWR, # 28.145-495) e congelare in aliquote a -80 ° C. Diluire soluzione di ECM in PBS alla concentrazione desiderata. Per MaxGel, diluire in DMEM (Dulbecco Modified Aquila americano, Invitrogen, # 11995-065). Se immunofluorescenza verrà effettuata, sterilizzare 12 vetrini circolari mm (VWR, # 89015-724) per immersione in etanolo e lasciare asciugare all'aria. Questo dovrebbe essere fatto all'interno della cappa laminare sterile. Se immunofluorescenza non verrà eseguita passare al punto 1.5. Posto sterilizzato coprioggetti in ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti (Corning, # 3526). Aggiungere 0,5 ml di soluzione di substrato diluito ad ogni pozzetto della piastra da 24 pozzetto ed incubare a temperatura ambiente per 3 ore. Aspirare dalla soluzione ECM e lavare threvolte posta in PBS. Aspirare off PBS e utilizzare immediatamente o avvolti in parafilm e conservati a 4 ° C per un massimo di 2 settimane. 2. Preparazione di strumenti di dissezione Piastre Sylgard con carbone aggiunto sono preparati secondo il protocollo del fabbricante. Lo sfondo nero resistente di queste targhe fornisce il supporto per appuntare giù l'embrione e il colore offre un buon contrasto che facilita la visualizzazione dell'embrione traslucido. Per preparare piatti pesare direttamente in un tri-versare becher su un equilibrio di parte 150 g Un liquido 15 g Parte B e 1 g di polvere di carbone (Strumenti di precisione del mondo, # SYLG184). Mescolare con un bastoncino di legno ghiacciolo o abbassalingua. Versare in vetro o plastica, 100 piatti cm. Utilizzare una piccola torcia butano tenuto circa 10 a 12 pollici sopra i piatti a bruciare eventuali bolle. Coperchi posto sulle piastre e lasciate riposare per almeno 24 ore per impostare. Per preparare strumenti di dissezione inserire un perno Minutien (0,1 millimetri diameter) in un supporto del perno (Belle Strumenti Scientific, # # 26.002-10 e 26.018-17, rispettivamente) in alternativa 26 aghi calibro (BD, # 309.597) piegate ad angolo retto con l'ausilio di pinze possono essere utilizzati come strumenti di dissezione. Affilato Student Dumont N ° 5 Pinza (Strumenti Scienza Fine, # 91150-20) con una pietra da affilatura (Belle Strumenti Scientifici, # 29008-22). Sterilizzare tutti gli strumenti di dissezione con il 70% di etanolo prima dell'uso. 3. Raccolta di embrioni Eutanasia il mouse a tempo in stato di gravidanza a 8.5 dopo coitum giorni secondo le norme di utilizzo degli animali della commissione e rimuovere utero. Utero Mettere in un piatto di plastica Petri con PBS sterile. Lavare utero una volta con PBS sterile. Sotto un microscopio dissezione rimuovere con attenzione embrione da deciduas utilizzando un paio di pinze. Rimuovere membrane extraembrionali e salvare per la genotipizzazione, se necessario. Embrione Fase contando somiti. Le tappe ideali per rendere espianti di analizzare cellulare behAvior durante neurale elevazione volte sarebbe tra i 6 e 10 tappe somite quando le pieghe neurali hanno appena iniziato a elevare e prima della morfogenesi principale del mesenchima cranica avviene. Lavare embrione in PBS. Mettere in un piatto nero Sylgard con DMEM che non contiene rosso fenolo (Invitrogen, # 21063-029). Rimuovere le membrane extraembrionali e salvare per la genotipizzazione, se necessario. 4. Preparazione di espianti Ridefinire il microscopio con l'ingrandimento più alto possibile sopra la regione della testa dell'embrione. Fare tagli con un ago dissezione in ogni mano. Impiegare un ago per tenere il tessuto in posizione e l'altra di effettuare tagli. Tagliare la testa dell'embrione anteriore ai rombomeri. Tagliare lungo la linea mediana per tagliare in due la testa in due metà uguali. Tagliare intorno ai margini esterni della testa e linea mediana. Questi tagli rimuoverà la cresta premigratory e ectoderma di superficie al confine esterno ela piastra precordale sulla linea mediana. Il tessuto rimanente sarà l'espianto e la migrazione conterrà la cresta neurale cranica, mesoderma parassiale e ectoderma di superficie. Quando il tessuto viene tagliato, rimuovere detriti sezionato dal piatto utilizzando una pipetta Pasteur sterile. Questo modo si evita di confondere il espianto con i detriti sezionato. Lavare delicatamente l'espianto da dell'uso lasciare equilibrare su e giù con una pipetta 20 pl punta e Pipetman. In questo modo rimuovere le cellule vagamente collegate e prevenire i bordi frastagliati sugli espianti. Cautela raccogliere ogni espianto in circa 10 ml di liquido utilizzando una punta di pipetta 20 microlitri e Pipetman e posto al centro della cultura rivestito bene. Aggiungere 20 ml di mezzo di coltura addizionato con 15% FBS a coprire l'espianto. Piastra posto in un incubatore umidificato tissutale (5% CO 2, 37 ° C) per 1-2 ore per consentire l'espianto di allegare al fondo del piatto. Guarda periodicamente per assicurare che l'espianto non asciugareout. Quando l'espianto è collegato, con cura aggiungere a ciascun pozzetto 250 microlitri DMEM supplementato con FBS 10% che è stato riscaldato a 37 ° C a bagnomaria. Una volta espianti hanno attaccato che non si muovano quando la piastra è leggermente scosso al microscopio. Ritorno piatto al tessuto cultura incubatore. Dopo 24 ore, gli espianti saranno saldamente e le cellule cominceranno a emigrare. In questo momento agenti farmacologici possono essere aggiunte al mezzo. 48 ore dopo la placcatura, le cellule si sono migrati dalle espianti. La distanza di migrazione possono essere visualizzati e creata l'immagine. Noi di solito fermare la cultura a questo punto da espianti cominciano a mostrare segni di vitalità diminuita con più lunghe incubazioni. Un colorante vitale come arancio acridina o trypan blu può anche essere utilizzato per controllare la vitalità della espianto. A questo punto le immagini possono essere acquisite per documentare la distanza e il numero di cellule che migrano dal espianto. In alternativa, se espianti sono state piastrate su vetrini,essi possono essere fissati e analisi immunoistochimiche effettuate per visualizzare proteine ​​di interesse. Passaggi critici nel protocollo Tagliare espianti di circa la stessa dimensione. Cancella tutti i detriti dissezione la piastra dissezione come si sta dissezione, per evitare detriti confondere con il tessuto desiderato espiantato. Quando espianti placcatura in pozzi o su vetrini essere sicuri di mettere goccia di media con espianto nel centro di bene. Lasciare espianto tempo sufficiente per collegare prima inondando il pozzo con i media. Condizioni di trattamento dovrebbero essere standardizzati per ogni substrato di prova e agente farmacologico utilizzato. Due espianti può essere fatto da ciascun embrione (uno a sinistra e uno da destra del tubo neurale). Quando la verifica della migrazione di cellule di linee mutanti di topo in diverse condizioni sperimentali, mettere un espianto mutante nel gruppo di controllo e l'altro nel gruppo trattato. Risoluzione dei problemi Se espianti non riescono a fissare, aumentare il tempo a disposizione per il fissaggio. Nella nostra esperienza, circa la metà degli espianti non attaccare e grandi espianti aderire in modo più efficiente. Se espianti attribuiscono alla periferia del pozzo che sarà difficile immagine. Assicurarsi di posizionare espianti nel centro del pozzo. Idealmente espianti saranno all'incirca le stesse dimensioni. Tuttavia, differenze nelle dimensioni espianto può essere corretto usando il diametro degli espianti come fattore di correzione quando quanitating migrazioni di cellule da espianti. In caso di contaminazione assicurarsi sterili condizioni di lavoro sono in uso. Tutti gli strumenti e le superfici di lavoro devono essere sterilizzati con etanolo 70%. Pipette e scatole di Petri devono essere nuovi e sterile. Se espianti sono sempre persi durante la dissezione, periodicamente rimuovere i detriti per evitare di perdere espianto. Padroneggiare la dissezione richiede molto tempo e ci vuole pratica. Optimal di ingrandimento, strumenti di dissezione taglienti e guida in aghi.