Nous décrivons la préparation de points quantiques colloïdaux dont la taille hydrodynamique réduit au minimum pour l'imagerie de fluorescence de molécules uniques. Par rapport aux points quantiques, ces nanoparticules ont une taille similaire à des protéines globulaires et sont optimisés pour une seule molécule de la luminosité, de la stabilité contre la photodégradation et la résistance à la liaison non spécifique des protéines et des cellules.
Une seule molécule d'imagerie est un outil important pour la compréhension des mécanismes de la fonction biomoléculaire et pour visualiser l'hétérogénéité spatiale et temporelle des comportements moléculaires qui sous-tendent la biologie cellulaire 1-4. À l'image d'une molécule individuelle d'intérêt, il est généralement conjugué à un marqueur fluorescent (colorant, de protéines, de perles, ou points quantiques) et observé avec épifluorescence ou fluorescence à réflexion interne totale (TIRF) microscopie. Alors que les colorants et les protéines fluorescentes ont été le pilier de l'imagerie de fluorescence pendant des décennies, leur fluorescence est instable sous haute flux de photons nécessaires pour observer les molécules individuelles, ce qui donne seulement quelques secondes d'observation avant la perte totale du signal. Des billes de latex et de perles colorant étiquetés assurer la stabilité du signal amélioré, mais au détriment de la taille hydrodynamique considérablement plus grande, ce qui peut altérer la diffusion délétère et le comportement de la molécule étudiée.
ntent "> Les quantum dots (QDs) offrent un équilibre entre ces deux régimes problématiques. Ces nanoparticules sont constituées de matériaux semi-conducteurs et peut être conçu avec une taille hydrodynamique compact avec une résistance exceptionnelle à la photodégradation 5. Ainsi, ces dernières années QDs ont joué un rôle en permettant aux observation à long terme du comportement complexe macromoléculaire sur le niveau de la molécule unique. Cependant, ces particules ont encore été trouvé exposer diffusion avec facultés affaiblies en environnements encombrés moléculaires tels que le cytoplasme cellulaire et synaptique neuronale de la fente, où leurs tailles sont encore trop grandes 4,6 , 7.Récemment, nous avons conçu les cœurs et les revêtements de boîtes quantiques de taille hydrodynamique réduite au minimum, tout en tenant compte des décalages à la stabilité colloïdale, photostabilité, la luminosité et la liaison non spécifiques qui ont entravé l'utilité des boîtes quantiques compacts dans le passé 8,9. Le but de cet article est de démontrerla synthèse, la modification et la caractérisation de ces nanocristaux optimisées, composée d'un alliage Cd Hg 1-x Se x noyau revêtu d'un isolant Zn Cd Y 1-Y S coquille, en outre revêtu avec un ligand polydenté polymère modifié par du polyéthylèneglycol court ( PEG) (figure 1). Par rapport aux nanocristaux de CdSe conventionnels, Hg x Cd 1-x Se alliages offrent de meilleures rendements quantiques de fluorescence, fluorescence à des longueurs d'onde rouge et proche infrarouge pour améliorer signal-sur-bruit dans les cellules, et d'excitation à la non-cytotoxiques longueurs d'onde visibles. Multidentés revêtements polymères se lier à la surface du nanocristal dans une conformation fermée et plane pour réduire au minimum la taille hydrodynamique, et PEG neutralise la charge de surface pour minimiser liaison non spécifique aux cellules et de biomolécules. Le résultat final est un nanocristal fluorescent vives avec des émissions entre 550-800 nm et une taille hydrodynamique totale près de 12 nm. C'est dans le sgamme de taille ame autant de protéines globulaires solubles dans les cellules, et sensiblement plus petits que les points quantiques conventionnels PEGylées (25-35 nm).
Par rapport aux points quantiques de CdSe, alliage ternaire Hg x Cd 1-x Se nanocristaux peuvent être réglés en taille et en longueur d'onde de fluorescence de manière indépendante. La taille est d'abord sélectionné lors de la synthèse de nanocristaux de CdSe noyaux, et la longueur d'onde de fluorescence est choisi dans une étape d'échange de cations mercure secondaire, qui ne modifie pas sensiblement la taille des nanocristaux 9. Il est important de laisser le m…
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs tiennent à remercier le Dr Hong Yi à la base Emory University microscopie intégrée pour l'imagerie par microscopie électronique. Ce travail a été financé par des subventions du NIH (PN2EY018244, R01 CA108468, U54CA119338 et 1K99CA154006-01).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Selenium | Sigma-Aldrich | 229865 | |
Tri-n-octylphosphine | Strem | 15-6655 | 97% pure, unstable in air |
Cadmium oxide | Sigma-Aldrich | 202894 | Highly toxic: use caution |
Tetradecylphosphonic acid | PCI Synthesis | 4671-75-4 | |
Octadecene | Alfa Aesar | L11004 | Technical grade |
Hexadecylamine | Sigma-Aldrich | H7408 | |
Diphenylphosphine | Sigma-Aldrich | 252964 | Pyrophoric |
Mercury acetate | Sigma-Aldrich | 456012 | Highly toxic: use caution |
1-Octanethiol | Sigma-Aldrich | 471836 | Strong odor |
Oleic acid | Sigma-Aldrich | W281506 | |
Zinc acetate | Alfa Aesar | 35792 | |
Cadmium acetate hydrate | Sigma-Aldrich | 229490 | Highly toxic: use caution |
Oleylamine | Fisher Scientific | AC12954 | Unstable in air |
Sulfur | Sigma-Aldrich | 344621 | |
Trioctylphosphine oxide | Strem | 15-6661 | 99% |
Pyridine | VWR | EM-PX2012-6 | Anhydrous |
Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M1753 | Strong odor |
Triethylamine | Sigma-Aldrich | 471283 | Anhydrous |
Dialysis tubing | Spectrum Labs | 131342 | 20 kDa cutoff |
Centrifugal filter | Millipore | UFC801024 | 10 kDa cutoff |
Monoamino-PEG | Rapp Polymere | 12 750-2 | 750 Da |
DMTMM, 4-(4,6-Dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride hydrate | Alfa Aesar | H26333 | |
AKTAprime Plus Chromatography System | GE HealthCare | ||
Superose 6 10/300 GL chromatography column | GE HealthCare | 17-5172-01 | |
Agarose, OmniPur | VWR | EM-2120 | |
Appendix Synthesis of mercury octanethiolate: Slowly add a methanol solution of mercury acetate (1 eq.) to a stirring solution of 1-octanethiol (3 eq.) and potassium hydroxide (3 eq.) in methanol at room temperature. Isolate the mercury(II) octanethiolate precipitate via filtration, wash two times with methanol and once with ether, and then dry under vacuum. Synthesis of multidentate polymer: Dissolve polyacrylic acid (1 g, 1,773 Da) in 25 ml dimethylformamide (DMF) in a 150 ml three-necked flask and bubble with argon for 30 min. Add an anhydrous solution of cysteamine (374 mg, 4.87 mmol) in 10 ml DMF. At room temperature with vigorous stirring, slowly add anhydrous diisopropylcarbodiimide (DIC, 736 mg, 5.83 mmol) over 30 min, followed by triethylamine (170 μl, 1.22 mmol), and allow the reaction to proceed for 72 hr at 60 °C. Add mercaptoethanol (501 mg, 6.41 mmol) to quench the reaction, and stir for 2 hr at room temperature. Remove DMF via rotary evaporation and isolate the polymer with the addition of a 2:1 mixture of ice-cold acetone:chloroform, followed by centrifugation. Dissolve the polymer in ~5 ml anhydrous DMF, filter, precipitate again with diethyl ether, and repeat. Dry the product under vacuum and store under argon. Determination of CdSe core diameter: From the UV-Vis absorption spectrum determine the wavelength of the first exciton peak (λ, in nm), which is the longest-wavelength peak (e.g. roughly 498 nm for CdSe in Figure 2a), and use the sizing curve of Mulvaney and coworkers 12: Determination of CdSe nanocrystal concentration: From a background-subtracted UV-Vis spectrum of an optically clear solution of CdSe nanocrystals, determine the absorption at 350 nm wavelength. Serial dilutions can be used to determine if the optical absorption is within the linear range of Beer’s Law. The nanocrystal concentration (QD, in M) can be determined by plugging in the nanocrystal diameter (D, in nm), the optical absorption value (A3sa), and the cuvette path length (l, in cm) into the following equation from the empirical correlation of Bawendi and coworkers 13: |