Visualisatie van bacteriële toxine geïnduceerde responsen met Live Cell Fluorescentie Microscopie
Summary
Werkwijzen voor het zuiveren van cholesterol binding toxine streptolysine O van recombinant<em> E. coli</em> En visualisatie van toxine te binden aan eukaryote cellen leven worden beschreven. Gelokaliseerde levering van toxine veroorzaakt een snelle en complexe veranderingen in gerichte cellen onthullen nieuwe aspecten van toxine biologie.
Abstract
Bacteriële toxinen binden aan cholesterol in membranen, vorming van poriën waarmee lekkage van cellulaire inhoud en instroom van materialen uit de externe omgeving. De cel kan herstellen van deze belediging, actief membraan herstelprocessen heeft, of anders sterven, afhankelijk van de hoeveelheid toxine blootstelling en celtype 1. Bovendien induceren deze toxinen sterke ontstekingsreacties in geïnfecteerde gastheren door activering van immuuncellen, zoals macrofagen, die een array van pro-inflammatoire cytokines 2 produceren. Veel Grampositieve bacteriën produceren toxinen die cholesterol binding is aangetoond dat hun virulentie dragen door grotendeels ongekarakteriseerde mechanismen.
Morfologische veranderingen in het plasmamembraan van cellen blootgesteld aan deze toxinen zijn onder opslag in cholesterol verrijkte oppervlaksuitsteeksels, die worden uitgescheiden in de extracellulaire ruimte, wat suggereert een intrinsieke cellulaire verdedigingmechanisme 3,4. Dit proces treedt op in alle cellen in afwezigheid van metabolische activiteit en kan worden gevisualiseerd met EM na chemische fixatie 4. In immune cellen zoals macrofagen die ontsteking bemiddelen als reactie op toxine blootstelling worden geïnduceerd membraanblaasjes voorgesteld cytokines van de IL-1 familie bevatten en kunnen verantwoordelijk zijn voor zowel vergieten toxine en verspreiding van deze pro-inflammatoire cytokines 5,6,7. Een koppeling tussen IL-1β afgifte en een specifiek type van celdood, is genoemd pyroptosis voorgesteld, aangezien beide caspase-1 afhankelijke processen 8. Te sorteren op de complexiteit van deze macrofagen reactie, die toxine binden, vergieten van membraan blaasjes, cytokine-afgifte, en mogelijk celdood omvat, hebben we etikettering technieken en fluorescentie microscopie methoden die het mogelijk maken voor real-time visualisatie van toxine-cel interacties, met inbegrip van metingen van disfunctie en dood (figuur 1). Gebruikenvan live cell imaging is nodig als gevolg van beperkingen in de andere technieken. Biochemische benaderingen niet kan oplossen die optreden bij de individuele cellen, terwijl flowcytometrie niet bieden een hoge resolutie, real-time visualisatie van de individuele cellen. De hier beschreven methoden kunnen worden toegepast op kinetische analyse van geïnduceerd door andere stimuli ingewikkelde fenotypische veranderingen in cellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hier beschreven technieken toe het onderzoek van de reacties van immuuncellen bacteriële toxinen. De belangrijkste stap is de behandeling en dosering van de toxine. Toxineactiviteit kunnen zeer variabel, zelfs bij verschillende hoeveelheden van hetzelfde preparaat door zijn broosheid. Dit vereist zowel het testen van elk aliquot van toxine tegen een referentie-cellijn of RBC's of met behulp van toxine hellingen. Toxine gradiënten, zoals die door micropipet, zodat het volledige spectrum van toxine-geïnduceerde …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag Richard Rest bedanken voor de gulle gift van anthrolysin O, Michael Caparon voor de gulle gift van de SLO plasmide en Jonathon Franken voor technische ondersteuning. Dit werk werd gefinancierd door NIH subsidie T32CA82084 (PAK), en R01AI072083 (RDS).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) | ||||||||||||||||||
| Ni-NTA agarose | Qiagen | 30210 | |||||||||||||||||||
| polymixin-agarose | Sigma | P1411-5ML | |||||||||||||||||||
| Zeba Desalt Spin col | Fisher | PI-89891 | |||||||||||||||||||
| sheep RBCs | Fisher | 50-415-688 | |||||||||||||||||||
| pBADgIII-SLO | N/A | N/A | see ref9 | ||||||||||||||||||
| Cy5 monoreactive dye | GE Healthcare | PA25001 | |||||||||||||||||||
| Fura2-AM | Life Technologies | F1221 | |||||||||||||||||||
| Calcein AM/ Ethidium homodimer | Life Technologies | L3224 | |||||||||||||||||||
| Anti-CD11c-APC | BD Biosciences | 550261 | |||||||||||||||||||
| collagen-coated glass-bottom dish | Mattek | P35GCol-1.5-10-C | |||||||||||||||||||
| femto-tip II | Fisher | E5242957000 | |||||||||||||||||||
| Microloader | Fisher | E5242956003 | |||||||||||||||||||
| dextran Alexa 555 | Life Technologies | D34679 | |||||||||||||||||||
| Injectman NI 2 | Eppendorf | 920000029 | |||||||||||||||||||
| FemtoJet | Eppendorf | 5247 000.013 | |||||||||||||||||||
Table 1. List and source of specific reagents and equipment needed. Specific equipment and reagents used in this protocol, along with company and catalogue number are listed. |
|||||||||||||||||||||
|
|||||||||||||||||||||
Table 2. List of buffers used in this protocol. The buffers used, their composition and the first step at which they are used in the protocol are listed. |
Referencias
- Walev, I. Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 3185-3190 (2001).
- Walev, I. Potassium regulates IL-1 beta processing via calcium-independent phospholipase A2. J. Immunol. 164, 5120-5124 (2000).
- Scolding, N. J. Vesicular removal by oligodendrocytes of membrane attack complexes formed by activated complement. Nature. 339, 620-622 (1989).
- Keyel, P. A. Streptolysin O clearance through sequestration into blebs that bud passively from the plasma membrane. J. Cell. Sci. 124, 2414-2423 (2011).
- MacKenzie, A. Rapid secretion of interleukin-1beta by microvesicle shedding. Immunity. 15, 825-835 (2001).
- Qu, Y., Franchi, L., Nunez, G., Dubyak, G. R. Nonclassical IL-1 beta secretion stimulated by P2X7 receptors is dependent on inflammasome activation and correlated with exosome release in murine macrophages. J. Immunol. 179, 1913-1925 (2007).
- Andrei, C. Phospholipases C and A2 control lysosome-mediated IL-1 beta secretion: Implications for inflammatory processes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 9745-9750 (2004).
- Franchi, L., Eigenbrod, T., Munoz-Planillo, R., Nunez, G. The inflammasome: a caspase-1-activation platform that regulates immune responses and disease pathogenesis. Nat. Immunol. 10, 241-247 (2009).
- Magassa, N., Chandrasekaran, S., Caparon, M. G. Streptococcus pyogenes cytolysin-mediated translocation does not require pore formation by streptolysin O. EMBO Rep. 11, 400-405 (2010).
- Pinkney, M., Beachey, E., Kehoe, M. The thiol-activated toxin streptolysin O does not require a thiol group for cytolytic activity. Infect. Immun. 57, 2553-2558 (1989).
- Watkins, S. C., Salter, R. D. Functional connectivity between immune cells mediated by tunneling nanotubules. Immunity. 23, 309-318 (2005).
- McNeil, P. L., Vogel, S. S., Miyake, K., Terasaki, M. Patching plasma membrane disruptions with cytoplasmic membrane. J. Cell. Sci. 113, 1891-1902 (2000).
- Shannon, J. G., Ross, C. L., Koehler, T. M., Rest, R. F. Characterization of anthrolysin O, the Bacillus anthracis cholesterol-dependent cytolysin. Infect. Immun. 71, 3183-3189 (2003).
