Человека нейроэндокринной опухоли клеточных линий в качестве трехмерных моделей по изучению прав нейроэндокринные опухоли терапия

1. Приготовление 1% агарозном покрытые 24-луночного планшета Добавить 1 г агарозы (RPI, A20090-500) до 100 мл дистиллированной воды в 250-500 мл бутылки и автоклав для стерилизации агарозы (121 ° C, 15 бар, 15 мин в автоклаве машины). Передача стерилизованные бутылки с агарозы в 70 ° С на водяной бане. Агарозном готова лить, когда она охлаждается до 70 ° C, которая занимает около одного часа. Убедитесь в том, чтобы сохранить агарозном стерильный во все времена. Получить 24-и плоские днища (Falcon, 353047); любой из 24-и плоские днища будет работать, если пластины могут быть отображены под фазово-контрастным микроскопом. Внесите 200 мкл агарозы в каждую лунку с пипетки Eppendorf ретранслятор в кабинете биобезопасности и вращать вокруг агарозы и сделать его покрытия и равномерно. 200 мкл агарозном целесообразно сформировать вогнутые поверхности, так что сфероидов может служить последовательное сферической формы. Менее 200 мкл агарозном не можетпокрытия и полностью, но более чем в 200 мкл агарозном не могут образовывать вогнутую поверхность и сфероидов выросли на это не может образовывать сферическую форму. Агарозном покрытием 24-луночных планшетах готовы для использования в 10 мин. (Опционально) Добавить 100 мкл среды, чтобы уравновесить агарозы с питательной среде до посева клеток. Кроме того, после агарозном полностью затвердевшего, добавьте 100 мкл питательной среде в каждую лунку и уплотнения плит со стерильным уплотнительная лента (Nunc, 236366). Эти плиты можно хранить при температуре 4 ° С в течение одной недели. 2. Подготовка единого суспензий Все эксперименты были выполнены с использованием стандартных асептики в шкафу биобезопасности и всех культур, выращенных в 37 ° C увлажненном инкубаторе с 5% CO 2 в воздухе, если не указано иное. NET поджелудочной железы человека БОН-1 клеток ведутся в DMEM/F12 (Invitrogen, 10565) с 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS, Invitrogen,16000-044) среды в 100 мм х 20 мм стерильную чашку культуре ткани (Corning, 430167). Когда монослой БОН-1 клеток достигает 70-80% слияния, средний удаляется. Клетки промывали PBS в два раза, и выбили из блюда, добавляя 1 мл TrypLE (Invitrogen, 12604) с 5 мин инкубации при 37 ° C. TrypLE похож на трипсин, но стабильным на уровне 15 – 30 ° C, а также при 4 ° C. Проверьте под микроскопом, чтобы убедиться, что все клетки отделяются от блюда. Добавить 9 мл питательной среды для трипсинизированных клетки и использовать пипетку пипетировать клетки вверх и вниз несколько раз, чтобы обеспечить еще одну клеточной суспензии. Использование 70-мкм ячейки фильтра (Fisher, 22363548) для фильтрации элементов. Сбор клеток и выполняют клеток использованием гуавы PCA-96 базовой системы (Millipore). Подготовить суспензию 5000 клеток на мл фенола без DMEM/F12 с 10% среднего роста FBS. 3. Сфероид культуры Наложение 200 мкл одногоклеточных суспензий в агарозном покрытые 24-луночного планшета и печать 24-луночных планшетах с стерильный уплотнительная лента для предотвращения испарения. Примечание: – количество ячеек, которые будут покрыты должна определяться эмпирически, исходя из размера сфероидов на 6-й день, 300-400 мкм в диаметре сфероидов бы идеальный размер для начала лечения наркозависимости, 1000 БОН-1 и H727 клетки высевают. – Мы не рекомендуем начинать медикаментозное лечение после 6-й день, потому что жизнеспособность клеток 3D начинает снижаться примерно на 10-й день (данные не приводятся, рукопись готовится к печати). Поместите выше агарозном покрытием 24-луночных планшетах с BON-1 клетки на орбитальном шейкере при очень медленном перемешивании менее 40 мин в течение ночи в 37 ° C увлажненном инкубаторе с 5% CO 2 в воздухе. Затем переместите эти пластины к стабильной платформы для постоянного наблюдения культур растет. Добавить 200 мкл питательной среде в каждую лунку над пластинойс каждые 3 дня. Не беспокоить сфероидов. Попробуйте добавить среды через стену каждую лунку, касаясь кончиком пипетки в сторону и дать хорошо стечь среду в колодец. Контроль за формированием сфероида в 24-луночных под микроскопом. 4. Лечению от наркотической зависимости Когда сфероидов составит около 300-400 мкм в диаметре на 6-й день, 3D сфероидов лечатся препаратами. Это обозначается как 0 день для лечения от наркозависимости. На 6-й день, каждую лунку пластинки содержит около 400 мкл среды. Чтобы убедиться, что медикаментозное лечение, по крайней 1x конечной концентрации в каждую лунку, 3x серийные разведения каждой дозы лечения из запасов лекарственных препаратов в 5 мл среды роста в 15 мл коническую трубку, которой достаточно для 8 повторениями. Сфероидов в каждой строке 24-луночного планшета относятся к категории транспортного средства, доза 1, 2, 3, 4 и 5. Есть 4 репликации для каждой дозы лечения на одного 24-луночного планшета (см. <stroнг> Таблица 1). Мы обычно лечат 3D сфероидов по крайней мере 2 24-луночных планшетов, которая делает по крайней мере 8 репликации для каждой дозы лечения. Спином вниз 24-луночного планшета на 800 оборотов в минуту в течение 5 мин при температуре 4 ° C, чтобы убедиться, что все конденсации на уплотнительную ленту идти в колодец. В связи с плавающими особенность 3D сфероидов, среда, в каждую лунку не удаляется, чтобы избежать нарушения сфероидов. Аккуратно добавить 200 мкл выше производства лечения каждой дозы в соответствующие лунки вдоль стенки лунки. Печать 24-луночных планшетах с уплотнительной лентой и инкубировать культур в 37 ° C увлажненном инкубаторе с 5% CO 2 в воздухе. При необходимости отступать сфероидов в каждую лунку с соответствующей дозой лечения после 72-96 часов. 5. Монитор 3D сфероид культур На каждый выбранный момент времени после медикаментозного лечения (0, 24, 48, 72 ч), сфероиды в каждую лунку тОн 24-луночного планшета загружаются с Zeiss Axiovert 200/M-based фазово-контрастной микроскопии использовании 5x цели. Примечание: Изображения могут быть приняты на любом световом микроскопе с калиброванных между мкм и пикселей. 5x целью является идеальным, поскольку сфероидов быстро перерасти изображений поле с 10-кратным цели. Сфероид анализ может быть выполнен вручную с помощью Zeiss AxioVision 4.8.2 программного обеспечения с сырой изображения. Кроме того, специально разработанные программы MATLAB используется для оценки размера сфероидов автоматически / полуавтоматически. Автоматическая программа реализует алгоритм активного контура 4 точно определить контуры сфероид в данное изображение и оценивать его основных (L) и мелкие (W) осями автоматически. Полуавтоматической версии одного и того же алгоритма позволяет пользователям, чтобы помочь инициировать программу, когда сильный артефакт присутствует. Все изображения должны быть экспортированы в формат TIFF или JPEG файласырые изображения, которые будут читать по программе. Объем сфероида оценивается в 0,5 х Д х Ш 2. 6. HistoGel-вложение NET 3D сфероидов 10-24 сфероидов собраны из 24-луночных планшетах, промывали в PBS в два раза, зафиксировано в 10% растворе формалина в течение 2 часов, промывают в 50% и 70% этанола в течение 15 минут два раза, соответственно, и готовы к вложению HistoGel. Кроме того, они могут быть сохранены в 70% этанолом при температуре 4 ° С в течение нескольких месяцев. Трубы холодного HistoGel (Thermo Scientific, HG-4000-012) помещают в стакан заполнен водой. Стакан нагревают в микроволновой печи в течение 1 мин или пока гель полностью сжиженный, то он находится в одном с водой стакан на все времена. Сфероидов в 70% этаноле сверху переданы в биопсии cryomold (ткань-Tek, Сакура Finetek, 4565) с помощью зубочистки. Убедитесь, что все сфероидов передаются. Пусть сфероидов сидеть на минуту, чтобы опуститься на дно биопси cryomold. Постарайтесь избавиться от жидкости в биопсии cryomold с Kimwipes а между тем, очень аккуратно вставьте сфероидов в центре внизу биопсии cryomold использования одноразовых пластиковых пипетки Пастера. Этот шаг может быть проще сделать при вскрытии микроскопом. Тонкий слой нагретой HistoGel добавляется к биопсии cryomold стабилизировать сфероидов в нижней части биопсии cryomold, а пока зубочистка используется для хранения сфероидов в центре внизу биопсии cryomold очень мягко. Не добавляйте слишком много HistoGel но достаточно для стабилизации сфероидов в нижней части биопсии cryomold. Пусть сфероидов / HistoGel сидеть в течение 1-2 мин при комнатной температуре или до HistoGel затвердевает. Затем заполнить остальные биопсии cryomold с подогретой HistoGel. Позвольте ему затвердевают при комнатной температуре в течение примерно 10 мин. Незадолго до выкатились сфероидов / HistoGel квартале от биопсии cryomold, залежьпосетили его при температуре 4 ° С в течение 1 мин, что позволяет выкатились нетронутыми сфероидов / HistoGel блока. Сфероидов / HistoGel блок затем завернуть в кусок Bio-обертывания (Surgipath, 01090) и положить в салфетку и биопсии кассеты (Fisher Scientific, 15-182-701D). Ткани и биопсия кассеты хранятся в контейнере с 70% этанола. Затем процедура обработки ткани процедуры парафин вложения следуют 5. Парафиновых блоков можно разделить на 3-мкм слой слайды. Слайды могут быть окрашены гематоксилином и эозином для определения гистологических изменений, а также может быть использован для иммуногистохимического окрашивания. 7. Представитель Результаты Человека нейроэндокринные опухоли поджелудочной железы клеточных линий БОН-1 (при условии, чтобы Verto институте Кьелл Оберг, Университет Упсала, Швеция), КГП-1 (японский Health Sciences Foundation, Осака, Япония) и легких человека нейроэндокринные опухоли линия H727 (АТСС) были выросли на agarosE-покрытием 24-луночного планшета. Как видно из рисунка 1, тремя клеточными линиями показаны различные морфологии. БОН-1 и H727 ячейки, образованные 3D сфероидов. Под микроскопом, H727 клеток показали, жесткие и более компактный, чем сфероидов BON-1 клеток. Мы предполагаем, что H727 клетки обладают повышенной способностью к межклеточной адгезии и образуют жесткие переходы в качестве результата. КГП-1 клетки показывают большие виноградные как пористая масса, которая не рассматривается в качестве сфероидов. В связи с ростом интереса поджелудочной нейроэндокринные опухоли исследований в последние годы, BON-1 клетки используются для остальных фигур. После посева БОН-1 клетки на агарозном покрытые 24-луночного планшета, формирование многоклеточных сфероидов обычно происходит на 3-й или 4-й день и сфероидов стал универсал на 6-й день. В связи с ограничением питательных веществ и кислорода, клетки в плотном ядре сфероидов начинают умирать вокруг 10-й день и в день 17 сфероидов начинает распадаться из-за большого размера или в такМне случаев выброса некротический стержень. Сфероидов правило, может вырасти до 1000 мкм в диаметре. На рисунке 2 показаны участки образование, рост и распад БОН-1 3D сфероидов. Медикаментозное лечение было начато, когда сфероиды было около 300-400 мкм и клетки сохранили высокую жизнеспособность (рукопись готовится к печати). День 6 3D сфероидов были выбраны в качестве начальной точки для лекарственной терапии. Сообщалось, что ингибиторы дезацетилазы гистонов показал антипролиферативное и проапоптотическую воздействие на клетки NET 6. Мы выбрали гистонов-деацетилаз ингибитора трихостатин (TSA), как пример, чтобы проиллюстрировать влияние лекарственной терапии на 3D NET сфероидов. 3А показывает Морфология 3D сфероидов на лечение АСП. Рисунок 3Б показывает объем 3D сфероидов на TSA (Sigma, T8552) лечения. Размер каждого сфероида оценивается автоматически клиТом развитой компьютерной программы MATLAB. 4 ступенчатая механическая рисунок был добавлен, чтобы помочь приобрести сфероидов, которые были ближе к краю в данном изображении. По крайней мере 8 сфероидов были измерены в дозе лечения АСП в каждый момент времени. Объем каждого 3D сфероид был рассчитан как 0,5 х длина х ширина 2. Как видно на рисунке 3A и 3B, относительно транспортного средства, все дозы TSA показано на рисунках показали некоторую степень ингибирования роста Бон-1 3D сфероидов. Среди них, концентрации 125 нм и 250 нм АСП сильно подавляется рост 3D сфероидов и привело к гибели клеток при 96-часовой момент времени. Чтобы понять, гистологии NET 3D сфероидов, H & E и иммуногистохимическое (ИГХ) окрашивание проводили на 3D сфероидов, которые были культивировали в течение 17 дней. Рисунок 4а показывает метод для обработки 3D сфероидов для HistoGel вложение, которое является ключевым шаг для парафина вложения 3D сферической OID. рисунок 4B показывает, H & E окрашивания, иммуногистохимического окрашивания дрова каспазы-3 (маркеров апоптоза клеток) и Ki-67 (маркера пролиферации клеток) антител на 3D сфероидов, которые культивировали в течение 17 дней . Клетки в основе 3D-сфероидов в основном некротические / апоптоза и внешний слой клеток активно растет. Рисунок 1. Морфология NET 3D сфероидов. 3D сфероидов из трех человек нейроэндокринные клеточные линии опухолей образуются на агарозном покрытые 24-луночных планшетах. 1000 БОН-1, H727 и КГП-1 клетки высевали на агарозном покрытые 24-луночных планшетах и ​​выросли в нормальных физиологических условиях, как указано в протоколе. Эти изображения 3D сфероидов для BON-1 и H727 или клеточных агрегатов для КГП-1, который культивировали в течение 10 дней. 18/4218fig2.jpg "ALT =" 2 "/> Рисунок 2. Рост Отслеживание БОН-1 3D сфероидов рост отслеживания БОН-1 сфероидов 3D.: Формирование, рост и распад 3D сфероидов. Как указано в протоколе, 1000 БОН-1 клеток высевали на агарозном покрытые 24-луночного планшета. Клетки, выращенные в стандартных DMEM/F12 среде с 10% FBS на орбитальном шейкере в физиологическом состоянии на ночь, затем перешел на стабильную платформу и вырос в том же состоянии. Рост отслеживания 3D-клетки следуют изображения клеток каждый час в течение первых 5 часов после покрытия, а затем каждые 1-3 дня с Zeiss Axiovert 200/M-based фазово-контрастной микроскопии использовании 5x цели. Клетки совокупности в массы, а затем образуют многоклеточные агрегаты, небольшой сфероидов, больше сфероидов, и в конечном итоге сфероидов распадаться. Рисунок 3. TSA обработки на БОН-13D сфероидов. () Изображения 3D сфероидов на лечение АСП. Лечение группы: V – автомобиль (0,0025% ДМСО), D1-доза 1 (15,625 нМ TSA), D2-дозе 2 (31.25 нМ TSA), D3: доза 3 (62,5 нМ TSA), D4: доза 4 (125 нМ TSA ), D5: доза 5 (250 нМ TSA). Время обработки: 0 H – момент времени, что лечение началось на 6 день 3D сфероидов, 24 H, 48 H, 72 H и 96 Н моменты времени после начала лечения. 3D сфероидов были обследованы в каждый момент времени, как раньше. (B) Рост 3D сфероидов на лечение АСП. Основным (L) и мелкие (W) осей 3D сфероидов в (A) оцениваются автоматически программой Matlab в каждый момент времени лечения (0, 24, 48, 72 и 96 ч). Объем 3D сфероидов оценивается как 0,5 х Д х Ш 2. Объем сфероида на графике была в среднем на 8 повторяет ошибки и бар был рассчитан на базе 8 повторениями. Таблица 1.Схема медикаментозного лечения на 24-луночного планшета Рисунок 4а. Иллюстрация метод для обработки 3D сфероидов для HistoGel вложения. Метод для обработки 3D сфероидов для HistoGel вложения и иммуногистохимического окрашивания 3D сфероидов (A) обзор методов для обработки 3D сфероидов для HistoGel вложения. 3D сфероидов были заключены в HistoGel быть на том же уровне в cryomold биопсия, то HistoGel / сфероидов блок был завернут в синюю Bio-обертывания и переносятся в желтой кассете биопсии для парафина вложения. Рисунок 4B. H & E Окрашивание и иммуногистохимического окрашивания дня-17 3D сфероидов. (B), H & E окрашивания, иммуногистохимическое окрашивание Ki-67 и Расколотая каспазы-3 в 17-дневный 3D сфероидов. Рaraffin-секционного встроенные слайды были парафина и поиска антигена проводили с использованием CCI (Cell кондиционирования решение, Verana медицинской системы, # 711-065-152). Кролик поликлональных Ki-67 антитела (Abcam. # Ab833) и Расколотая каспазы 3 антитела (Cell технологии передачи сигналов, # 9661) были применены в концентрации 1:75 и 1:200, соответственно, в течение 1 часа при комнатной температуре. Анти-кролик вторичные антитела (Jackson Immunolab, # 711-065-152) был применен в 1:500 в течение 1 часа при комнатной температуре, а затем хромогенных обнаружения комплект DABMap (Ventana Medical Systems, # 760-124). Слайды были контрастно гематоксилином и обезвоженной и очищается перед coverslipping из ксилола.