Hücre Özgül Analizi<em> Arabidopsis</em> Floresans Aktif Hücre Ayırma kullanma Leaves
Summary
Üretmek için bir yöntem<em> Arabidopsis</em> Belirli hücre popülasyonlarının çalışmaları için izin floresan aktive hücre sıralama (FACS) ile uyumlu yaprak protoplast. Bu yöntem, herhangi bir uyumlu<em> Arabidopsis</emHücrelerinin bir alt kümesi olarak GFP ifade> satırı.
Abstract
Yaprak primordium'un başlangıcından sonra, biyomas birikim esas olarak hücre çoğalması ve yaprak 1 genişleme tarafından kontrol edilir. Bununla birlikte, Arabidopsis yaprağı çok farklı hücre tipleri ve çeşitli yapılar oluşan bir kompleks bir organdır. Aynı zamanda, büyüyen yaprak genişleyen durdurmak ve yaşlanması 1. geçmesi için ilk olmanın sapı en uzak hücreler, farklı gelişim aşamalarında hücreler içerir. Yaprağın içinde farklı hücreler bu nedenle bölünmesi uzayarak veya ayırıyoruz; aktif stresli veya ölü ve / veya herhangi bir zamanda kendi hücresel tip alt setleri uyaranlara yanıt. Bu yaprak zorlu genomik araştırma yapar: örneğin farklı hücresel yanıt bölgeler veya hücre tiplerinde faaliyet genetik ağların bütün yaprakları, sinyallerinden ifade verileri analiz ederken şaşırmış olacak, üretilen yanlış bir profil elde edilir.
Bu adres için, several yöntemler hücre spesifik gen ifadesi çalışmalar imkan veren tarif edilmiştir. Bu lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) 2 veya protoplast nesil ve sonraki floresan aktive hücre sıralama (FACS) 3,4, nükleer yağış 5 ve polysomes 6 immünopresipitasyon için son açıklanan INTACT sistemi için kullanılan GFP ifade bitkileri bulunmaktadır.
FACS başarılı bir şekilde kök ucu hücre kimlik ve mesafe 3,7 genlerin büyük bir sayısını ifade profilleri üzerinde önemli bir etkisi olduğunu gösteren da dahil olmak üzere bir dizi çalışma için kullanıldı. GFP hatlarının FACS da kök azot yanıtları ve lateral kök gelişimi 8, tuz stresine kök 10 9 oksin dağıtımı sırasında hücre spesifik transkripsiyonel düzenleme göstermek ve Arabidopsis sürgün apikal meristem 11 bir gen ekspresyonu harita oluşturmak için kullanılır olmuştur. RağmenFACS önce otofloresans 12,13 dayalı Arabidopsis yaprak elde protoplast sıralamak için kullanılır olmuştur, yapraklarda GFP ifade Arabidopsis hatlarında FACS kadar kullanımı 4 çok sınırlı olmuştur. Aşağıdaki protokol biz protoplast nesil rejiminin etkilerini en aza FACS uyumlu Arabidopsis Yaprak protoplast elde etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Biz vasküler doku 14 ve TP382 Arabidopsis doğrultusunda, ifade GFP çift GFP ifade adaxial epidermisin 14 KC274 doğrultusunda, ifade GFP bir nükleer lokalizasyon sinyal bağlantılı yapıtaşıdır KC464 Arabidopsis hattı kullanarak yöntem gösterilmektedir bekçi hücreleri (veriler gösterilmemiştir; Şekil 2). Şu anda, ihtiyarlık çeşitli evrelerinde her iki hücre tipi geliştirme ve stres esnasında spesifik ifade, hem de heterojen hücre popülasyonları incelemek için bu yöntemi kullanarak.
Protocol
Discussion
Biz protoplast nesil ve FACS kullanan sonraki hücre sıralama için yapraklarda GFP ifade Arabidopsis bitkilerin kullanımına izin veren bir yöntem tarif var. Bu yöntem, qPCR veya mikroarray ya tarafından amplifikasyon ve bu yüzden bir sonraki analiz için kullanılacak olan RNA, yeterli miktarlarda elde edilir. Kriteri fraksiyonlar son derece olarak qPCR (Şekil 2) ile gösterilen GFP-içeren hücreler için zenginleştirilmiştir.
Yaprak şeritler inhibitörü içeren protoplast solüsyonu ile infiltre vakum olmuştur kadar canlı protoplast yüksek verimi elde etmek için bu prosedürün ilk adımları sırasında hızla çalışmak önemlidir. Buna ek olarak, 1 mm yaprak şerit üretirken, bu aşırı hasar ve bu nedenle daha düşük bir protoplast verim neden olarak, yapraklar yerine "kesme" püre ya da bunların dilim veya kesim için çok önemlidir.
Yöntemi arasındaki kritik fark burada ve diğer publishe tarifd yöntem RNase inhibitörleri ve transkripsiyonel inhibitörlerinin kullanımı. Çoğu yöntemleri protoplast daha kolay elde edilebilir hangi Arabidopsis kökleri için geliştirilmiştir. Bununla birlikte, mezofil hariç, yaprakları ile çalışma zaman, protoplast üretim süresini artırmak için gereklidir. Bu nedenle, protoplast kuşak tedavinin kendisi (veriler gösterilmemiştir) bir sonucu olarak gen ekspresyonu değişikliklere karşı korumak için bu inhibitörleri dahil etmek önemlidir. Ancak, inhibitörlerin varlığı bu stresinden karşı hangi ile plastisite kaybına neden olarak protoplast daha savunmasız yapmak olasıdır kapalı genlerin veya geçiş yoluyla, bir transkripsiyon yanıt monte için bir yetersizlik yol açar prosedürü protoplasting.
Biz, GFP-ifade eden Arabidopsis hatları bir dizi ile başarılı bir şekilde burada tarif edilen yöntem kullanılmıştır. Önemlisi, biz GFP hatları ya kuvvetli GFP ifade ile bu yöntemi kullanmışçekirdek, ya da çok daha zayıf bir non-localized/diffuse sitosolik bir şekilde, burada kullanılan KC464 ve KC274 hatları ile bir durumdur. Hatları Her iki tip yöntem ile uyumlu olan ve GFP-ifade eden protoplast arasında yüksek oranda zenginleştirilmiş fraksiyon için (Şekil 2 ve 3) elde edildi. Fluorofor ölü / ölüm hücreleri otofloresans canlı hücreleri seçmek için yeteneğimizi korumak amacıyla önemli ölçüde farklı olduğu floresans seçilmelidir rağmen metod, diğer floroforlar adapte olabilir.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Hücre tipine ve gelişim evrelerine özgü profil üzerine Buchanan-Wollaston laboratuarında çalışma Avrupa Komisyonu 6. Çerçeve Programı'nın en AGRON-omics projesi (hibe # LSHG-CT-2006-037704) tarafından desteklenmektedir. Hücre tipine özgü profil üzerine Gifford laboratuarda çalışmak bir BBSRC Yeni Araştırmacı hibe (BB/H019502/1) tarafından desteklenmektedir.
KC274 ve KC464 Arabidopsis hatları AAR Webb (Cambridge University of) elde edilmiştir.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Cellulase R-10 | Melford | C8001 |
| Cellulase RS | Melford | C8003 |
| Macerozyme R-10 | Melford | M8002 |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3912 |
| ProtectRNA | Sigma-Aldrich | R7397 |
| Actinomycin D | Sigma-Aldrich | A1410 |
| 70 μm cell strainer | Fisher | FB35181 |
| 50 μm filcon cup-type filters | BD Biosciences | 340630 |
Referencias
- Efroni, I., Eshed, Y., Lifschitz, E. Morphogenesis of Simple and Compound Leaves: A Critical Review. Plant Cell. 22, 1019-1032 (2010).
- Kleber, R., Kehr, J. Preparation and Quality Assessment of RNA From Cell-Specific Samples Obtained by Laser Microdissection. Methods Mol. Biol. 323, 367-377 (2006).
- Birnbaum, K., Shasha, D. E., Wang, J. Y., Jung, J. W., Lamberts, G. M., Galbraith, D. W., Benfey, P. N. A Gene Expression Map of the Arabidopsis root. Science. 302, 1956-1960 (2003).
- Warnasooriya, S. N., Montgomery, B. L. Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. (39), e1925 (2010).
- Beal, R. B., Henikoff, S. A Simple Method For Gene Expression and Chromatin Profiling of Individual Cell Types Within a Tissue. Dev. Cell. 18, 1030-1040 (2010).
- Mustroph, A., Zanetti, M. E., Jang, C. J. H., Holtan, H. E., Repetti, P. P., Galbraith, D. W., Girke, T., Bailey-Serres, J. Profiling translatomes of discrete cell populations resolves altered cellular priorities during hypoxia in Arabidopsis. PNAS. 106, 18843-18848 (2009).
- Brady, S. M., Orlando, D. A., Lee, J. Y., Wang, J. Y., Koch, J., Dinneny, J. R., Mace, D., Ohler, U., Benfey, P. N. Dominant Root Expression Patterns Revealed in a High-Resolution Spatiotemporal Expression Map. Science. 318, 801-806 (2007).
- Gifford, M. L., Dean, A., Gutierrez, R. A., Coruzzi, G. M., Birnbaum, K. D. Cell-specific nitrogen responses mediate developmental plasticity. PNAS. 105, 803-808 (2008).
- Dinneny, J. R., Long, T. A., Wang, J. Y., Jung, J. W., Mace, D., Pointer, S., Barron, C., Brady, S. M., Schiefelbein, J., Benfey, P. N. Cell identity mediates the response of Arabidopsis roots to abiotic stress. Science. 320, 942-945 (2008).
- Peterson, S. V., Johansson, A. I., Kowalczyk, M., Makoveychuk, A., Wang, J. Y., Moritz, T., Grebe, M., Benfey, P. N., Sandberg, G., Ljung, K. An Auxin Gradient and Maximum in the Arabidopsis Root Apex Shown by High-Resolution Cell-Specific Analysis of IAA Distribution and Synthesis. Plant Cell. 21, 1659-1668 (2009).
- Yadav, R. K., Girke, T., Pasala, S., Xie, M., Reddy, G. V. Gene expression map of the Arabidopsis shoot apical meristem stem cell niche. PNAS. 106, 4941-4946 (2009).
- Harkins, K. R., Jefferson, R. A., Kavanagh, T. A., Bevan, M. W., Galbraith, D. W. Expression of photosynthesis-related gene fusions is restricted by cell type in transgenic plants and in transfected protoplasts. PNAS. 87, 816-820 (1990).
- Yang, Y., Costa, A., Leonhardt, N., Siegel, R. S., Schroeder, J. I. Isolation of a strong Arabidopsis guard cell promoter and it’s potential as a research tool. Plant Methods. 4, 6 (2008).
- Gardner, M. J., Baker, A. J., Assie, J. -. M., Poethig, R. S., Haseloff, J. P., Webb, A. A. R. GAL4 GFP enhancer trap lines for analysis of stomatal guard cell development and gene expression. J. Exp. Bot. 60, 213-226 (2009).
