Сотовые конкретного анализа<em> Arabidopsis</em> Листья Использование флуоресценции клеток, активированных Сортировка
Summary
Способ получения<em> Arabidopsis</em> Лист протопласты, которые совместимы с флуоресценции активирован сортировки клеток (FACS), что позволяет для исследования конкретных клеточных популяций. Этот метод совместим с любой<em> Arabidopsis</em> Линия, которая выражает GFP в подмножество клеток.
Abstract
After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the Arabidopsis leaf is a complex organ made up of many different cell types and several structures. At the same time, the growing leaf contains cells at different stages of development, with the cells furthest from the petiole being the first to stop expanding and undergo senescence1. Different cells within the leaf are therefore dividing, elongating or differentiating; active, stressed or dead; and/or responding to stimuli in sub-sets of their cellular type at any one time. This makes genomic study of the leaf challenging: for example when analyzing expression data from whole leaves, signals from genetic networks operating in distinct cellular response zones or cell types will be confounded, resulting in an inaccurate profile being generated.
To address this, several methods have been described which enable studies of cell specific gene expression. These include laser-capture microdissection (LCM)2 or GFP expressing plants used for protoplast generation and subsequent fluorescence activated cell sorting (FACS)3,4, the recently described INTACT system for nuclear precipitation5 and immunoprecipitation of polysomes6.
FACS has been successfully used for a number of studies, including showing that the cell identity and distance from the root tip had a significant effect on the expression profiles of a large number of genes3,7. FACS of GFP lines have also been used to demonstrate cell-specific transcriptional regulation during root nitrogen responses and lateral root development8, salt stress9 auxin distribution in the root10 and to create a gene expression map of the Arabidopsis shoot apical meristem11. Although FACS has previously been used to sort Arabidopsis leaf derived protoplasts based on autofluorescence12,13, so far the use of FACS on Arabidopsis lines expressing GFP in the leaves has been very limited4. In the following protocol we describe a method for obtaining Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with FACS while minimizing the impact of the protoplast generation regime. We demonstrate the method using the KC464 Arabidopsis line, which express GFP in the adaxial epidermis14, the KC274 line, which express GFP in the vascular tissue14 and the TP382 Arabidopsis line, which express a double GFP construct linked to a nuclear localization signal in the guard cells (data not shown; Figure 2). We are currently using this method to study both cell-type specific expression during development and stress, as well as heterogeneous cell populations at various stages of senescence.
Protocol
Discussion
Мы описали метод, который позволяет использовать Arabidopsis растений, экспрессирующих GFP в листьях для генерации протопластов и последующей сортировки клеток с использованием FACS. Этот метод дает достаточного количества РНК, которые будут использоваться для усиления и поэтому последующий анализ либо КПЦР или микрочипов. Фракции отсортированы высоко обогащенные для GFP-содержащие клетки, как показали КПЦР (рис. 2).
Для достижения высоких урожаев живой протопластов важно работать быстро в течение первых шагов процедуры, пока листья полосы были вакуум проникли с ингибитором содержащих протопластов решение. Кроме того, при создании 1 полосы мм листа очень важно, чтобы нарезать или вырезать листья, а не «отбивную» или пюре из них, так как это приводит к чрезмерному повреждению и, следовательно, более низкую доходность протопластов.
Существенная разница между методом, описанным здесь и другие publisheг методов является использование ингибитора РНКазы и транскрипционной ингибиторов. Большинство методов разработаны для Arabidopsis корней, от которых протопласты могут быть получены более легко. Тем не менее, при работе с листьями, за исключением мезофилла, необходимо увеличить время протопластов поколения. Поэтому важно, чтобы включить эти ингибиторы для защиты от изменения в экспрессии генов в результате лечения протопластов поколение само по себе (данные не представлены). Тем не менее, наличие ингибиторов приводит к невозможности установить транскрипции ответа, либо путем переключения генов или выключить, которая, вероятно, чтобы сделать протопластов более уязвимы, так как это приводит к потере пластичности, с которыми по борьбе с напряжениями protoplasting процедуры.
Мы использовали метод, описанный здесь успешно число GFP-экспрессирующих Arabidopsis линий. Важно отметить, что мы использовали этот метод с GFP линий, экспрессирующих GFP либо сильно вядро, или гораздо более слабо в non-localized/diffuse цитозольного образом, как и в случае с KC464 и KC274 линии, используемые здесь. Оба типа линий совместимы с методом и получением обогащенного доли GFP-экспрессирующих протопластов (рис. 2 и 3). Этот метод может быть легко адаптирована к другим флуорофоры, хотя флуорофора должны быть выбраны для флуоресценции, что существенно отличается от аутофлюоресценции мертвых / умирающие клетки для того, чтобы сохранить возможность выбора живых клеток.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Работа в Бьюкенен-Волластон лаборатории по камерного типа и стадии развития конкретных профилей при поддержке Агрон-омик проекта (грант № LSHG-CT-2006-037704) в 6-й Рамочной Progamme Европейской комиссии. Работа в лаборатории Гиффорд по камерного типа конкретных профилей поддерживается BBSRC новый следователь гранта (BB/H019502/1).
KC274 и KC464 Arabidopsis линии были получены из AAR Уэбб (Кембриджский университет).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Cellulase R-10 | Melford | C8001 |
| Cellulase RS | Melford | C8003 |
| Macerozyme R-10 | Melford | M8002 |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3912 |
| ProtectRNA | Sigma-Aldrich | R7397 |
| Actinomycin D | Sigma-Aldrich | A1410 |
| 70 μm cell strainer | Fisher | FB35181 |
| 50 μm filcon cup-type filters | BD Biosciences | 340630 |
Referencias
- Efroni, I., Eshed, Y., Lifschitz, E. Morphogenesis of Simple and Compound Leaves: A Critical Review. Plant Cell. 22, 1019-1032 (2010).
- Kleber, R., Kehr, J. Preparation and Quality Assessment of RNA From Cell-Specific Samples Obtained by Laser Microdissection. Methods Mol. Biol. 323, 367-377 (2006).
- Birnbaum, K., Shasha, D. E., Wang, J. Y., Jung, J. W., Lamberts, G. M., Galbraith, D. W., Benfey, P. N. A Gene Expression Map of the Arabidopsis root. Science. 302, 1956-1960 (2003).
- Warnasooriya, S. N., Montgomery, B. L. Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. (39), e1925 (2010).
- Beal, R. B., Henikoff, S. A Simple Method For Gene Expression and Chromatin Profiling of Individual Cell Types Within a Tissue. Dev. Cell. 18, 1030-1040 (2010).
- Mustroph, A., Zanetti, M. E., Jang, C. J. H., Holtan, H. E., Repetti, P. P., Galbraith, D. W., Girke, T., Bailey-Serres, J. Profiling translatomes of discrete cell populations resolves altered cellular priorities during hypoxia in Arabidopsis. PNAS. 106, 18843-18848 (2009).
- Brady, S. M., Orlando, D. A., Lee, J. Y., Wang, J. Y., Koch, J., Dinneny, J. R., Mace, D., Ohler, U., Benfey, P. N. Dominant Root Expression Patterns Revealed in a High-Resolution Spatiotemporal Expression Map. Science. 318, 801-806 (2007).
- Gifford, M. L., Dean, A., Gutierrez, R. A., Coruzzi, G. M., Birnbaum, K. D. Cell-specific nitrogen responses mediate developmental plasticity. PNAS. 105, 803-808 (2008).
- Dinneny, J. R., Long, T. A., Wang, J. Y., Jung, J. W., Mace, D., Pointer, S., Barron, C., Brady, S. M., Schiefelbein, J., Benfey, P. N. Cell identity mediates the response of Arabidopsis roots to abiotic stress. Science. 320, 942-945 (2008).
- Peterson, S. V., Johansson, A. I., Kowalczyk, M., Makoveychuk, A., Wang, J. Y., Moritz, T., Grebe, M., Benfey, P. N., Sandberg, G., Ljung, K. An Auxin Gradient and Maximum in the Arabidopsis Root Apex Shown by High-Resolution Cell-Specific Analysis of IAA Distribution and Synthesis. Plant Cell. 21, 1659-1668 (2009).
- Yadav, R. K., Girke, T., Pasala, S., Xie, M., Reddy, G. V. Gene expression map of the Arabidopsis shoot apical meristem stem cell niche. PNAS. 106, 4941-4946 (2009).
- Harkins, K. R., Jefferson, R. A., Kavanagh, T. A., Bevan, M. W., Galbraith, D. W. Expression of photosynthesis-related gene fusions is restricted by cell type in transgenic plants and in transfected protoplasts. PNAS. 87, 816-820 (1990).
- Yang, Y., Costa, A., Leonhardt, N., Siegel, R. S., Schroeder, J. I. Isolation of a strong Arabidopsis guard cell promoter and it’s potential as a research tool. Plant Methods. 4, 6 (2008).
- Gardner, M. J., Baker, A. J., Assie, J. -. M., Poethig, R. S., Haseloff, J. P., Webb, A. A. R. GAL4 GFP enhancer trap lines for analysis of stomatal guard cell development and gene expression. J. Exp. Bot. 60, 213-226 (2009).
