Un procedimiento optimizado para el activado por fluorescencia de células de clasificación (FACS) El aislamiento de progenitores neurales autónomas de los órganos viscerales de los fetos de ratones
Summary
Siguiendo un procedimiento optimizado para purificar la cresta neural, derivados progenitores neuronales a partir de tejidos fetales de ratón se ha descrito. Este método aprovecha de expresión de alelos reportero fluorescentes para aislar poblaciones discretas por clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). La técnica se puede aplicar para aislar las subpoblaciones neuronales en todo el desarrollo o de tejidos adultos.
Abstract
Durante el desarrollo de la cresta neural (NC) de los progenitores neuronales derivados de migrar fuera del tubo neural para formar los ganglios autonómicos en los órganos viscerales como el intestino y el tracto urinario inferior. Tanto durante el desarrollo y en los tejidos maduros estas células son a menudo muy dispersos a lo largo de los tejidos por lo que el aislamiento de las poblaciones discretas utilizando métodos como la captura de micro-disección con láser es difícil. Sin embargo, pueden ser vistas directamente por la expresión de los periodistas fluorescentes expulsados de las regiones reguladoras de genes específicos de neuronas, como tirosina hidroxilasa (TH). Se describe un método optimizado para altos rendimientos de TH + viables progenitoras neuronales de tejidos de ratón fetales viscerales, incluyendo intestino y tracto urogenital inferior (LUT), basado en la disociación y activado por fluorescencia de células de clasificación (FACS).
El gen codifica Th. la enzima limitante para la producción de catecolaminas. Entéricas progenitores neuronales empiezan a expresar TH duranteIng su migración en el intestino del feto 1 y TH también está presente en un subconjunto de neuronas de los ganglios pélvicos adultos 2-4. La primera aparición de este linaje y la distribución de estas neuronas en otros aspectos de la LUT, y su aislamiento no se ha descrito. Progenitores neuronales que expresan TH pueden ser fácilmente visualizados por la expresión de EGFP en ratones portadores del transgén construcción Tg (Th-EGFP) DJ76Gsat/Mmnc 1. Hemos fotografiado la expresión de este transgén en los ratones fetales para documentar la distribución de las células TH + en la LUT desarrollando a 15,5 días post coito (dpc), la designación de la mañana de detección de conexión de hasta 0,5 dpc, y observó que un subconjunto de células progenitoras neuronales en la coalescencia pélvica ganglios expresa EGFP.
Para aislar LUT TH + progenitores neuronales, hemos optimizado los métodos que se utilizaron inicialmente para purificar las células troncales de la cresta neural del intestino delgado de ratón fetal 2-6. Los esfuerzos anteriores para aislar a Carolina del Norte derivados de las poblaciones en que se basadigestión con un cóctel de la colagenasa y tripsina para obtener suspensiones de células de citometría de flujo. En nuestras manos estos métodos producen suspensiones de células de la LUT con la viabilidad relativamente bajo. Teniendo en cuenta la incidencia ya baja de los progenitores neuronales en los tejidos fetales TUS, nos propusimos optimizar los métodos de disociación de tal manera que la supervivencia celular en las finales se disocia se incrementaría. Se determinó que la gentil disociación en Accumax (Tecnologías Innovadoras celulares, Inc), el filtrado manual, y el flujo de la clasificación a bajas presiones, que nos permitió lograr una supervivencia constantemente mayor (> 70% del total de células), con rendimientos posteriores de progenitores neuronales suficientes para el análisis de aguas abajo. El método se describe pueden ser ampliamente aplicadas para aislar una variedad de poblaciones neuronales de cualquiera de los tejidos murinos fetales o un adulto.
Protocol
Discussion
Líneas de ratones que expresan reportero reporteros fluorescentes están siendo ampliamente disponibles a través de los múltiples esfuerzos de la comunidad de la genética murina 1,8,9. Como resultado, el método de disociación se ilustra aquí se puede aplicar ampliamente para el aislamiento de discretos subtipos neuronales basadas en neurotransmisor o patrones de expresión del receptor de cualquiera de los tejidos fetales o un adulto. Si bien hemos optimizado este método basado en la expresión de un …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a Catalina Alford para obtener sugerencias sobre los métodos de disociación celular y Weller Kevin Flaherty David Matlock y Bretaña para el apoyo en la citometría de flujo de recursos compartidos en la Vanderbilt University Medical Center y Melissa A. Musser para la asistencia artística con ilustraciones. Agradecemos a los Dres. Jack Mosher y Sean Morrison para el asesoramiento en la implementación de aislamiento de progenitores neuronales. La Citometría de Flujo de Recursos VMC compartido con el apoyo de la Vanderbilt Ingram Cancer Center (P30 CA68485) y el Vanderbilt de Enfermedades Digestivas del Centro de Investigación (P30 DK058404). Este trabajo fue apoyado por fondos de EE.UU. Institutos Nacionales de Salud subvenciones DK064251, DK086594 y DK070219.
Materials
| Reagent Name | Vendor | Catalog number | Comments |
| Accumax | Sigma(mfr: Innovative Cell Technologies) | A7089-100ML | Store frozen in 1 ml aliquots |
| DNase I | Sigma | D-4527 | Stored frozen at -20 °C 5 mg/ml in 1xHBSS, (Used in Quench, Quench 1:5) |
| 10X PBS pH 7.4 | Gibco | 70011-044 | Make up to 1x with tissue culture grade water then sterile filter |
| 10X HBSS w/o Ca or Mg | Gibco | 14185-052 | Make up to 1x with tissue culture grade water then sterile filter |
| Leibovitz’s L-15 medium | Gibco | 21083027 | |
| Penicillin /Streptomycin 100X | Gibco | 15140-133 | Store aliquoted at -20 °C |
| BSA | Sigma | A3912-100G | Store aliquoted at -20 °C, 100 mg/ml in water |
| Biowhittaker 1M HEPES in 0.85% NaCl | Lonza | 17-737E | |
| 38 μm NITEX Nylon Mesh Membrane | Sefar America | 3-38/22 | Cut into ~3 cm squares. UV treat overnight to sterilize in the tissue culture hood. |
| 7-AAD | Invitrogen | A1310 | 1 mg/ml |
| TRIzol LS | Invitrogen | 10296-028 | |
| 5 ml polystyrene tubes | Falcon | 352058 | |
| 15 ml conical tubes | Corning | 430790 | |
| Fine Dissecting Forceps | Fine Science Instruments | 11251-30 | Dumont#5 forcep, Dumoxel, standard tip 0.1×0.06mm |
| Dissecting Spoon | Fine Science Instruments | 10370-18 |
Referencias
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