一个<em>在体外</em>共感染模型研究<em>恶性疟原虫</em人原发性单核细胞源性的免疫细胞-HIV-1相互作用

注：与HIV-1和恶性疟原虫的实验必须在适当的生物安全水平实验室（BSL2寄生虫，BSL3 HIV-1和共同感染），可能受感染的人体血液中使用时，必须采取特殊的预防措施。 1。外周血单个核细胞（PBMC）的分离纯化（基于8日和9） 开始从新鲜的人体血液与抗凝剂（肝素，柠檬酸，柠檬酸盐葡萄糖或柠檬酸磷酸葡萄糖）治疗的健康献血者（500毫升）。净化和整个协议的其余部分隔离PBMC和使用无内毒素的试剂。 用70％乙醇消毒，包括管，血袋，切管，小心地转移到T150大掌柜瓶血。 准备15毫升淋巴细胞分离介质，每50毫升锥形管（确保Ficoll分离已经达到室温）（Ficoll分离）16管。仔细层顶部的新鲜血液30毫升。 离心30分钟在400 XG在20°Ç折断。 在离心，准备8×50 ml锥形管，室温汉克的平衡盐溶液（HBSS中）每管25毫升。 仔细接口多云细胞环（包含PBMC），转移至50毫升的试管中的HBSS（池2每管细胞环）。完成量上升至50 ml HBSS中。 离心15分钟，在150 XG在20°Ç上休息。 在阴天的细胞环离心，收集黄色上层Ficoll分离的步骤，血浆池，填补了50毫升锥形管。灭活血浆中补充50毫升管加热在56℃，30分钟旋转10分钟为1800 xĞ。保持上清（含稀释自体血浆可以作为介质在稍后的步骤的补充）。 小心取出上清液和resuspenð从步骤1.7在25毫升的HBSS和池2颗粒每50毫升管细胞沉淀。在8分钟的300 XG旋转20°C 小心去除上清，并在10毫升的HBSS和池在一个50毫升管的悬浮颗粒。 采取等份，进行台盼蓝排斥，以评估死亡率和再算上PBMC中。 完整的体积为50毫升的HBSS和自旋10分钟300×Ğ。去除上清，悬浮在5X10 6细胞/ ml的细胞在RPMI 1640（应该约400-500×10 6 PBMC中获得500毫升血液）。 2。单核细胞源性巨噬细胞（MDM）的分化（基于8日和9） 种子约1.25×10 8 PBMC的RPMI 1640培养液（25毫升/皿）在15厘米菜。 让细胞坚持1-2小时，在37°C，5％CO 2气氛。 转让非贴壁细胞，在一个新瓶，并用15毫升内毒素免费PBS两次（5板分钟，300 XG）。贴壁细胞是孤立的单核细胞。 为了让新鲜分离的单核细胞分化成的MDM，加入20毫升5％自体血浆（从1.8步）的RPMI 1640培养基。加入重组人巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF的25毫微克/毫升）和青霉素/链霉素溶液（聚苯乙烯，100 U / mL青霉素，100μg/ mL链霉素）。孵育2天，改变培养基孵育2-3额外天在37°C，5％的CO 2气氛。 删除旧的介质，并用内毒素无PBS一次，添加的PBS轻轻立即吸。要分离的MDM充分分​​化，治疗在37°C〜7毫升Accutase（Accutase，蛋白酶和胶原溶解的活性，使细胞从塑料盘支队市售的混合）在5％CO2的细胞为15-20分钟2的气氛，在中旬时轻轻摇动。 在每盘添加3-5毫升自体血浆（从1.8步）（以帮助保护细胞刮）。 轻轻刮去确保介质覆盖在任何时候，在转让50毫升管/池细胞的细胞。 用大量的内毒素无PBS板恢复尽可能多的细胞。 旋转200 XG 5分钟，弃上清。 5毫升MDM培养基（10％灭活补胎牛血清白蛋白（iFBS），聚苯乙烯，25毫米肝素钠补充）和计数细胞（MDM的产生通常是2-8％总的PBMC）的RPMI 1640重悬沉淀。注：在这一步可能会采取的MDM等分，以评估流式细胞仪检测细胞纯度人口，通常获得99％的MDM的快递CD14的。 种子1×10 5的MDM MDM的文化介质在24孔板，每孔600μL。 37℃孵育过夜在5％的CO 2感染前的气氛。 3。生产和定量的HIV-1病毒的股票生产中使用磷酸钙转染HEK293T细胞follo病毒股翼福尔廷等协议10。 为了获得20微克任NL4.3 吕克 + 环境保护与单周期内含有编码荧光素酶报告基因的病毒，共同转染HEK293T细胞- R +和的pHCMV-G的10微克，或15微克NL4.3 吕克环境保护 – R +和15微克pJRFL ENV。使用30微克的NL4.3 吕克 + 环境保护- R的+生成控制糖蛋白缺陷病毒。对于完全复制病毒，使用30微克的NL4.3Bal ENV。向量pHCMV-G的和pJRFL ENV编码水泡性口炎病毒包膜糖蛋白（VSV-G的）和1 CXCR5的嗜性HIV-1（比NL4.3Bal ENV不同），分别。可从8质粒的额外信息。质粒可通过美国国立卫生研究院艾滋病研究和参考程序（NIAID的，NIH）。 所有使用病毒酶联免疫吸附股票量化的HIV-1 P24衣壳蛋白11，并在使用前确认其感染的潜力。我们评估我们储存的天花病毒的传染性，通过使用TZM-BL指标细胞12。 4。文化疟原虫的寄生虫（13） 4.1寄生虫一般文化和维护保持体育恶性疟原虫 3D7人类红细胞1的RPMI 1640 4％血细胞比容辅以0.5％（W / V）Albumax二，25微克/毫升庆大霉素（25毫米肝素钠和25毫米碳酸氢钠3缓冲）（血组Ø+）的无性阶段的寄生虫370μM次黄嘌呤在37°C在1％氧气/氮气中5％的二氧化碳的混合气体。 原虫可以监视由薄涂片的文化，有15％姬姆萨液染色。 始终保持在未受感染的红血细胞在相同条件下（uRBC）培养皿寄生虫作为控制使用。 为了获得后期parasitES（滋养体/早期裂殖），同步的寄生虫如下： 4.2寄生虫同步在早晨，收获寄生虫文化，在300 XG旋转5分钟，弃上清。 5包装的细胞量在5％（W / V）的D-山梨醇，并培育5分钟在37°C重悬浮颗粒旋转300×Ğ5分钟，丢弃30毫升的培养基上清，重悬沉淀，并在孵化器回。 约8小时后，重复步骤4.2.1至4.2.3为了获得紧密同步的寄生虫。后期寄生虫（滋养体/早期裂殖），然后可以收获第二天早上进行的实验。净化前，进行姬姆萨染色，以确认生命周期阶段。 4.3 恶性疟原虫感染的红血细胞（iRBC）净化消毒用70％乙醇和p VarioMacs分离器（支架和磁铁）花边生物罩下。 修复三通阀CS列的底部。 切针与美天旎的特殊刀具，塑料保护和修复针活塞底部。 磁铁锁入列仔细。 MDM培养基10毫升，用拧左边的活塞套件封闭注射器慢慢注入删除列中的所有气泡。 用〜20毫升MDM培养基列。 收获培养板中的红细胞，洗一次10毫升的MDM培养基（300 XG，5分钟）和红细胞颗粒悬浮在12毫升的MDM培养基。慢慢地添加到列中，并通过让悬浮流（只感染的红血细胞中含有寄生虫滋养体或裂殖阶段，将保留的磁场由于存在hemozoin晶体）。 洗一次20毫升中，当它到达列顶部的白色圆盘，停止液体流动。 删除列磁铁和12毫升MDM培养基在一个干净的无菌管流出iRBC。 涂抹等份的恢复iRBC并进行姬姆萨染色，以确认生命周期阶段。 计数恢复iRBC使用血球（隔离红细胞是100％iRBC）。 颗粒细胞（300 XG，5分钟），弃上清和细胞治疗500μL新鲜AB +人血清（opsonisation第14步）。 在37°C，5％的CO 2气氛中孵育30分钟。 洗一次10毫升MDM的文化媒介（300× 克 ，5分钟），所需浓度重悬iRBC。通常，10％，原虫15厘米培养皿大致给出〜0.5 1×10 8紧密同步iRBC。 5。暴露于疟原虫的MDM 的MDM揭露到uRBC或iRBC的，细胞必须被悬浮在MDM培养基中，以获得一个uRBC / iRBC比例：75:1的MDM。在先前准备24孔板的MDM添加适当的红细胞悬浮液的体积，以每口井。执行一式三份的所有实验。 在37°C，5％的CO 2气氛中孵育4小时的共同文化。 600μL内毒素的PBS 3次洗涤细胞，添加在PBS轻轻吸立即。 裂解剩下的红细胞，加入200μl无菌水冰冷的20秒和吸洗井。 加入600μLMDM培养基中培养24小时，在37°C，5％的CO 2气氛。 6。完全复制型HIV-1感染的MDM 为了评估体育的影响疟原虫在MDM，对HIV-1病毒复制增加，根据图1A，10毫微克的P24 NL4.3Bal 包膜病毒在适当的井（300μL的MDM媒体）所列的计划，只添加在控制井的MDM中等。 在37°C孵育2小时5％CO 2气氛。 洗细胞，内毒素的PBS 3次添加的PBS轻轻吸立即。加入600μl新鲜的MDM培养基每口井的。 在37°C孵育5％的CO 2气氛中。 在3天，6，9及12后，病毒感染的开始，收获每个上清200μL，加入200μl新鲜MDM介质的其后。保持在-20℃的收获上清，用ELISA福尔廷等10后的主要HIV-1衣壳p24蛋白定量。 7。单周期病毒编码荧光素酶与感染的MDM 以确定寄生虫的艾滋病毒在MDM-1基因表达的影响，添加，根据计划概述图1B，10纳克P24任NL4.3 吕克 + 环境保护 （300μL的MDM培养基） – R的+（ VSV-G的），NL4.3 luc +的环境保护- R的+（JRFL ENV）或NL4.3 吕克 +环境保护- R的+病毒在相应的井。 在37°C孵育2小时，5％的CO 2气氛。 600μL内毒素的PBS 3次洗涤细胞，添加在PBS轻轻吸立即。加入600μl新鲜的MDM培养基每口井的。 在37°C孵育5％的CO 2气氛中。 删除中期的72小时以下的感染，并添加200μL裂解缓冲液1X（与荧光素酶检测试剂盒提供）。让细胞在室温下溶解，轻轻摇动。贮存于-20°C 解冻板和40微升裂解液转移到一个96光度计板的;添加荧光素酶底物100μL（与荧光素酶检测试剂盒提供）和测量的荧光素酶（萤火虫荧光素酶）在制造商的指示后光度计活动。 8。代表结果用我们的共同感染模型，我们表明，exposurE的体育疟原虫到MDM的降低HIV-1感染的易感性。事实上，一个显着减少（P级<0.05; 2路方差分析，12天）中释放病毒颗粒，HIV-1上清液中的P24衣壳蛋白衡量，观察预处理与寄生虫（ 图2A）在MDM。这一观察也证实由编码荧光素酶报告基因的病毒感染的细胞。 MDM的与窝藏无论是外源性的，VSV-G或HIV-1糖蛋白的这种病毒的感染导致显着（P <0.05，学生t-检验）荧光素酶在细胞暴露在体育生产恶性疟原虫 （ 图2B）。值得注意的是，VSV-G假型病毒产生了更大的荧光素酶活性比他们JRFLenv同行，这是由于VSV-G的15假型粒子的感染效率。由于寄生虫博览会MDM的影响，这两种类型的病毒，这表明它影响一些病毒基因前一步pression（ 图2B）。同样重要的是提细胞活力没有影响的MDM博览会到iRBC（数据未列出），表明观察到的抑制是具体的，而不是由于细胞死亡率。 图1。一）为MDM感染板计划完全复制病毒的模拟：未受感染的细胞。 uRBC：细胞暴露给未受感染的红血细胞。 iRBC：细胞暴露到恶性疟原虫感染的红血细胞。 BAL：。NL4.3Bal ENV巴尔/ uRBC的感染细胞：细胞暴露到uRBC感染与NL4.3Bal ENV巴尔/ iRBC的： 暴露与ENV 乙 NL4.3Bal iRBC和感染的细胞）为MDM感染板计划单周期内的荧光素酶编码病毒的模拟：未受感染的细胞。 uRBC：细胞暴露给未受感染的红血细胞。 iRBC：细胞接触到疟原虫 -Infected红血细胞。 δenv：感染的细胞与NL4.3 吕克 + 环境保护- R的。JRFL：与NL4.3 吕克 + 环境保护感染的细胞- R的+（JRFL ENV）。 VSV-G：受感染的细胞与NL4.3 吕克 + 环境保护- R的+（VSV-G）Δenv/ uRBC：细胞暴露到uRBC和与感染NL4.3 吕克 + ENV-R +Δenv/ iRBC的细胞暴露iRBC感染NL4.3 吕克 + 环境保护- R的+ JRFL / uRBC：细胞暴露到uRBC和感染NL4.3 吕克 + 环境保护- R的+（JRFL ENV）。 JRFL / iRBC：细胞暴露到iRBC和感染NL4.3 吕克 + 环境保护- R的+（JRFL的ENV）。 vsv-g/uRBC：细胞暴露到uRBC和感染NL4.3 吕克 + 环境保护- R的+（VSV-G）vsv-g/iRBC：细胞暴露到iRBC和感染NL4.3 吕克 + 环境保护- R的+ （VSV-G）。 <img alt="图2" src="/files/ftp_upload/4166/4166fig2.jpg"/> 图2。一）对恶性疟原虫对HIV-1号病毒在MDM生产的MDM暴露到uRBC或iRBC比率​​75:1（uRBC / iRBC：MDM）为4小时和广泛洗净。 ENV NL4.3Bal 2小时P24 10ng细胞感染病毒生产用ELISA监测HIV-1在不同的时间点，最初的病毒感染后无细胞上清的P24。一个有代表性的试验显示B）对恶性疟原虫对HIV-1号病毒的转录在MDM MDM的比率75:1（uRBC / iRBC：感染与uRBC或iRBC的。，MDM）。细胞，然后感染与10ng P24单周期病毒（或者NL4.3 luc +的环境保护- R的+，NL4.3 吕克 + 环境保护 – R +（JRFL ENV）或NL4.3 luc +的环境保护- R的+（VSV- g）条）。荧光素酶的表达进行了评估，在细胞裂解物72小时后，最初的病毒感染。一个有代表性的实验证明。