Kültür Yetişkin Dorsal Root Ganglion Nöronlar ile Axon Rejenerasyon Genetik Çalışma
Summary
Bir<em> In vitro</emKültürlü yetişkin fare dorsal kök ganglion nöronlar ile akson rejenerasyonu genetik çalışma için> modeli açıklanmıştır. Metodu genetik manipülasyon geçiren nöronlarla akson yeniden büyümesini izin vermek için bir re-suspension/re-plating adım içerir. Bu yaklaşım, RNAi bazlı protein Knockdown kullanarak akson rejenerasyonu kaybı fonksiyon-çalışmaları için özellikle yararlıdır.
Abstract
Biliyorsunuz, merkezi sinir sistemi (MSS) olgun nöronlar olgun MSS 1,2 olarak akson büyüme ve düşmanca bir ortamı desteklemek için azalmış içsel yeteneği nedeniyle yaralanmalar sonra kendi aksonlar rejenere olamaz bilinmektedir. Bunun aksine, periferal sinir sisteminde olgun nöronlar (PNS) yaralanmalar 3 sonra kolaylıkla yeniden. Yetişkin dorsal kök ganglion (DRG) nöronlar da periferik sinir hasarı sonrası sağlam yeniden bilinmektedir. Çevresel hedefler ve omuriliğe uzanan bir merkezi şube innerve eden periferik dalı: Her DRG nöron hücresi soma gelen, hangi dallar iki akson dalları içine bir akson yetişir. Önemli akson rejenerasyonu DRG periferik aksonlar sonuçları Sakatlık, omurilikte aksonlarda ise yaralanma sonrası kötü rejenere. Periferik aksonal yaralanma omurilik yaralanması (bir süreç klima lezyon olarak adlandırılır), aksonlarda rejenerasyon önce oluşur Ancak, greatl olduğunuy 4 artırıldı. Ayrıca, DRG nöronların aksonlarda omurilikte kortikospinal aksonlar inen aynı düşmanca bir ortamda paylaşabilirsiniz. Birlikte, bu yetişkin DRG nöronların akson rejenerasyonu kontrol moleküler mekanizmalar MSS akson rejenerasyonu arttırmak için boyunduruk edilebilir tahminler yapılmıştır. Sonuç olarak, yetişkin DRG nöronlar artık yaygın rejeneratif akson büyüme 5-7 incelemek için bir model sistemi olarak kullanılmaktadır.
Burada, in vitro olarak akson rejenerasyon genetik çalışma için kullanılabilir yetişkin DRG nöron kültürü için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu model yetişkin DRG nöronların genetik elektroporasyon-aracılı gen transfeksiyon 6,8 ile manipüle edilir. DNA plazmid veya si / shRNA, bu yaklaşım yetişkin DRG nöronlardan gelen akson büyüme herhangi bir gen-of-ilgi rolünü araştırmak için hem kazanç ve kayıp fonksiyon-deneyleri ile sağlayan nöronlar transferiyle. Nöronlar si / shRNA ile transfekte edilmiş olduğunda, hedeflenen endojen proteinidirgenellikle-kaybı fonksiyon testlerinde daha az etkili hale, zaman sağlam akson büyüme zaten ortaya sırasında kültür 3-4 gün sonra tükendi. Bu problemi çözmek için, burada tarif edilen yöntem aksonlardan hedef proteinin yokluğunda nöronlar den yeniden büyümesini sağlar transfeksiyon sonrasında yeniden süspansiyon ve re-kaplama adımı da içerir. Son olarak, yetişkin DRG nöronların 9 akson büyüme aracı bir akson rejenerasyonu ile ilişkili gen, c-Jun, rolünü incelemek için in vitro model bu kullanarak bir örnek sağlar.
Protocol
Discussion
Yetişkin DRG nöronlar böylece yetişkin hayvanlarda akson rejenerasyonu incelemek için yararlı bir sistem sağlayarak, sağlam in vivo ve in vitro periferik sinir hasarı sonrası kendi aksonlar rejenere. Yetişkin DRG nöronların in vitro kültüründe moleküler mekanizmaları araştırmak için yaygın olarak kullanılan bir yöntem haline geliyor hangi akson rejenerasyonu düzenlenir. Kültür yetişkin fare DRG nöronların in vitro prosedürü burada rejeneratif akson büy…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma NIH (R01NS064288) ve Craig H. Neilsen Vakfı FZ hibe ile desteklenmiştir.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| MEM | Invitrogen | 11090-081 |
| Poly-D-Lysine hydrobromide | Sigma -Aldrich | P6407 |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 |
| 5-fluoro-2-deoxyuridine | Sigma -Aldrich | F0503 |
| Uridine | Sigma -Aldrich | U3003 |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604-013 |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10270-098 |
| Penicillin-streptomycin (100X) | Invitrogen | 15140-122 |
| GlutaMAX-I (100X) | Invitrogen | 35050-038 |
| Glass coverslips (#1) | Electron Microscopy sciences | 72196-12 |
| 24 well cell culture plate | Becton Dickinson | 35-3047 |
| 1X PBS | Mediatech | 21-040-CV |
| Sterile, distilled and deionized water | Mediatech | 25-055-CV |
| Nucleofector and electroporation Kits for Mouse Neurons | Lonza | VPG-1001 |
| ON-TARGETplus siRNA against c-Jun | Dharmacon | L-043776 |
| Anti–βIII tubulin antibody (Tuj-1) | Covance | MMS-435P |
| ProLong Gold Antifade mounting solution | Invitrogen | P36930 |
Referencias
- Yiu, G., He, Z. Glial inhibition of CNS axon regeneration. Nat. Rev. Neurosci. 7, 617-627 (2006).
- Liu, K., Tedeschi, A., Park, K. K., He, Z. Neuronal Intrinsic Mechanisms of Axon Regeneration. Annu. Rev. Neurosci. , (2010).
- Zhou, F. Q., Snider, W. D. Intracellular control of developmental and regenerative axon growth. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 361, 1575-1592 (2006).
- Neumann, S., Woolf, C. J. Regeneration of dorsal column fibers into and beyond the lesion site following adult spinal cord injury. Neuron. 23, 83-91 (1999).
- Liu, R. Y., Snider, W. D. Different signaling pathways mediate regenerative versus developmental sensory axon growth. J. Neurosci. 21, RC164 (2001).
- Zhou, F. Q. Neurotrophins support regenerative axon assembly over CSPGs by an ECM-integrin-independent mechanism. J. Cell Sci. 119, 2787-2796 (2006).
- Zou, H., Ho, C., Wong, K., Tessier-Lavigne, M. Axotomy-induced Smad1 activation promotes axonal growth in adult sensory neurons. J. Neurosci. 29, 7116-7123 (2009).
- Zhou, F. Q., Zhou, J., Dedhar, S., Wu, Y. H., Snider, W. D. NGF-induced axon growth is mediated by localized inactivation of GSK-3beta and functions of the microtubule plus end binding protein APC. Neuron. 42, 897-912 (2004).
- Saijilafu, E. M., Hur, F. Q., Zhou, Genetic dissection of axon regeneration via in vivo electroporation of adult mouse sensory neurons. Nat. Commun. 2, 543-54 (2011).
- Costigan, M. Replicate high-density rat genome oligonucleotide microarrays reveal hundreds of regulated genes in the dorsal root ganglion after peripheral nerve injury. BMC Neurosci. 3, 16 (2002).
- Xiao, H. S. Identification of gene expression profile of dorsal root ganglion in the rat peripheral axotomy model of neuropathic pain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 8360-8365 (2002).
- Michaelevski, I. Signaling to transcription networks in the neuronal retrograde injury response. Sci. Signal. 3, ra53 (2010).
