小鼠胰岛的朗格汉斯的分离纯化的胶原酶和中性蛋白酶结合使用
Summary
小鼠胰岛分离的详细描述描述原位胰腺导管插管和灌注纯化的胶原酶和中性蛋白酶的组合中使用的技术。
Abstract
β细胞的基因表达和功能的体外正视转移的询问多年来的研究孤立的啮齿类动物胰岛细胞从啮齿动物致瘤细胞株的研究。主要的小岛提供了独特的优势，他们更忠实地反映细胞内的信号转导通路的生物学特性及分泌反应。而胰岛分离的方法组织解离酶（TDE）的筹备工作已经确立1-4的许多实验室，在任何给定的啮齿动物应变的的胰岛产量和质量的一致性的变化限制的范围和主要胰岛研究的可行性。这些变化经常会出现作为一个结果，部分纯化的粗胰岛的分离过程中使用的TDES; TDES经常表现出特定对特定活动的变化，并常常需要调整所用的酶的剂量。纯化TDES啮齿动物细胞隔离5，6，少数报告</suP>，但这种做法并不普遍，尽管日常使用和纯化TDES人胰岛隔离的优势。在与VitaCyte，LLC（印第安纳波利斯，IN）的协作，我们开发了一种修饰的小鼠的胰岛分离协议基于Gotoh琴桥7，8，在该TDES灌注直接进入胰管小鼠，随后粗组织分馏通过所述的一个HISTOPAQUE梯度9纯化的胰岛细胞，并进行隔离。甲我们的协议的显着差异是纯化的胶原酶（CI 酶马萨诸塞州）和中性蛋白酶（CI 酶 BP）的组合使用。胶原酶，其特征在于通过使用6荧光胶原降解活性（CDA）的检测，利用荧光标记的可溶性小腿皮肤纤维作为基板6。此衬底是更预测组织基质中的胶原降解的动力学，因为它依赖于天然胶原作为基板。该蛋白酶为ch的aracterized与一个敏感的荧光动力学分析10。利用这些改进的检测与传统的生化分析，使TDE制造更一致，批次间的一致性来提高性能。在这里描述的协议进行了优化，以获得最大的的胰岛产量和最佳胰岛形态C57BL / 6小鼠。胶原酶和中性蛋白酶在此协议的发展过程中，有几个组合进行了评估在不同浓度，胶原酶：中性蛋白酶35:10的最终比例-Σ型XI代表酶的性能相媲美。因为在不同品系的小鼠和大鼠胰岛产量平均显着的变化已有报道，额外的修改的TDE组成的，应以提高产量和质量的不同品种和品系的胰岛细胞恢复。
Protocol
Discussion
在这个协议中，我们已经描述了我们的程序插管术，胶原酶灌注，分离的小鼠胰腺与胰岛分离的目标。从技术上讲，我们的方法，一旦掌握了，应该允许在4分钟内实施安乐死的动物的胰腺隔离，1小时应该从一个单一的动物在隔离的小岛。该技术的快速性允许我们分离胰岛从最多至12只小鼠，在一个典型的拉伸，从而导致高达3000胰岛隔离。
我们的协议与其它协议不同，胶原酶制剂的使用原油，设有纯化的蛋白酶，CI 酶胶原酶MA和CI 酶 BP蛋白酶的使用。 TDE制剂市售的一致性的变化，需要每个特定单独测试和优化一般使用之前。这很多很多的变化，促使我们考虑使用纯化田间的TDES从VitaCyte。这些高度纯化的TDES其特征在于由多个敏感的荧光标记底物测定的使用方法，包括。的荧光CDA检测是更加敏感，不同的分子形式的胶原酶降解天然胶原蛋白具有不同的动力学。历史的多肽底物检测提供胶原酶的评估是不完整的。特征胶原酶多种方法，确保批次间更大的酶的活性。
根据我们的内部测试，使用各种市售胶原酶制剂，我们发现，纯化的酶组合，产生了很多很多的重复的结果。在此应用程序中使用的高纯度和严格的特点TDES的主要优点是一次最佳的酶组成的定义，很多很多的性能的一致性是有保证的。这种一致性消除劳动力密集的过程通常需要很多资质原油或丰富胶原酶产品。纯化的TDES也使额外的修改，以提高产量和质量的胰岛细胞恢复从不同的小鼠品系的组成。报告最佳的酶分离胰岛的组合物可更有效地从不同品系的小鼠连通。这反过来又导致更有效的使用资源，提高灵活性，在实验设计中。
有很多关键的步骤，可以影响胰岛的隔离使用我们的协议的结果。第一个是需要的酶制剂的灌注过程中，以实现有效的通货膨胀的胰腺。重要的是要启动注射器上的通胀温和的力量，和增加胰腺充气力。移动的肠子和解除通胀，使的胶原酶灌注整个器官，胰腺是有帮助的。另一个关键步骤是一甩头管竣工后的力ŕ孵化，在37°C（2.2）。我们发现，难防摇胰腺管帽引起的胰岛细胞的分裂，但没有任何形式的机械分离这一步，胰岛产量大幅下降。此外，还必须在与注射器（步骤2.5）的解离步骤，一个中等级别的力被施加在与柱塞的向上和向下运动期间，这之前的滤波步骤（2.6），以确保有足够的组织分离，其中很少组织应保留在滤茶器过滤器。最后，最后一个步骤仔细遵循的是在整个20毫升的HISTOPAQUE分离胰岛细胞的愿望。虽然的小岛是典型的在界面上的HISTOPAQUE和HBSS，我们已经发现，我们失去了小岛时，我们尝试只删除接口，相反，我们现在可以删除整个20毫升，用大口径25毫升的移液管。我们添加了过滤，以消除需要通过倒置70微米的过滤器（2.11）到centrifuge的小岛，反复洗去HISTOPAQUE。
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作是支持的，部分由美国国立卫生研究院资助DK060581 R01，R01 DK083583（包括RGM）。
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue # | |||||||||
| 10X HBSS | Life Technologies | 14065 | |||||||||
| RPMI | Fisher Scientific | 10-040 | |||||||||
| BSA | Sigma Aldrich | any | |||||||||
| Histopaque 1077 | Sigma Aldrich | 10771 | |||||||||
| Histopaque 1119 | Sigma Aldrich | 11191 | |||||||||
| 4-0 Suture 100 yd roll | McKesson | 451521 | |||||||||
| 14 g blunt end needle | Fisher Scientific | 14-8216M | |||||||||
| Vannas Superfine Sciss | Fisher Scientific | 501778 | |||||||||
| Curved Spring Scissors | Fisher Scientific | 14127 | |||||||||
| Curved Forceps (2) | Fisher Scientific | 15914G | |||||||||
| Curved forceps (for 90 °) | Fine Science Tools | 11052-10 | |||||||||
| 27G 1/2 inch needle | Fisher Scientific | 305109 | |||||||||
| 30G 1/2 inch needle | Fisher Scientific | 305106 | |||||||||
| PE tubing | Becton Dickinson | 427411 | |||||||||
| Collagenase MA | Vitacyte, LLC | 001-2030 | |||||||||
| BP Protease | Vitacyte, LLC | 003-1000 | |||||||||
| 3 ml syringe | Fisher Scientific | 309585 | |||||||||
| 30 ml syringe | Fisher Scientific | 309650 | |||||||||
| 70 μm filter | Fisher Scientific | 352350 | |||||||||
| 10 cm2 Petri Dish | Fisher Scientific | 351005 | |||||||||
| Plastic tea strainer | Any kitchen supply | ||||||||||
| Table 1. Reagents and Equipment | |||||||||||
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Table 2. Average islet yields (±SD) using different TDE lots* *Data represent average islet yields from at least 10 mice. Lot numbers in parentheses |
Referencias
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