Generación, purificación y caracterización de especies invasivas en células de proteína DISC1

1. Preparación de células de donante aggresome: Transfección de monomérico proteína fluorescente roja (mRFP) o aumento de proteína verde fluorescente (EGFP)-etiquetados humana de longitud completa (FL) DISC1 Seed 1,5 x 10 6/10 cm plato de neuroblastoma humano NLF (NLF, el Hospital de Niños de Filadelfia, Filadelfia, PA) en las células de diez platos de 10 cm y crecer durante la noche. Células del FNL se cultivan en RPMI-1640 suplementado con 10% FBS, penicilina / Strepomycin, L-Glutamina. El día siguiente, las células deben estar en una confluencia del 70-80%. Transfectar transitoriamente cada placa de 10 cm con 15 g de ADN plásmido y reactivo de transfección Metafectene (Biontex, Martinsried, Alemania). En breve, para un plato de 10 cm, 15 g de ADN plásmido y 30 Metafectene l se añadieron a 750 l de Opti-MEM, se mezcló y se incubó a TA durante 20 min. 5 platos fueron transfectadas con pcDNA3.1 mRFP / EGFP-etiquetados humanos (FL) DISC1 y 5 platos con el solo eGFP-plásmido. 2. AggresomeLa purificación de las células del donante transfectadas El protocolo descrito aquí es una combinación de un método para purificar Lewy-Cuerpos de tejido de cerebro 13 y un protocolo para aislar grandes agregados y aggresomes 14. Dado que los métodos ya existentes se basan en el uso de detergentes, el aislamiento de detergente libre de proteínas para la aplicación en ensayos de invasividad de las células-es crítica. 48 h después de la transfección, controlar la expresión de eGFP y mRFP/eGFP-DISC1 y confirmar la formación de aggresomes bajo un microscopio de fluorescencia (Figura 1). Lavar las células con PBS pH 7,4, raspar con 400 l de PBS cada una, añadir cóctel 1X inhibidor de proteasa (Roche, Indianapolis, IN) y romper las células utilizando un homogeneizador Precellys24 (Bertin Technologies, Francia). En pocas palabras, añadir 1 ml de suspensión celular a un tubo de lisis 2 ml y añadir 10 gotas de cerámica. Lisar las células con 3 x 60 pulsos por segundo. La fuerza mecánica del proceso puedeaumentar la temperatura dentro de la muestra por encima de 37 ° C, de modo se debe tener cuidado para enfriar la muestra en hielo después de que el procedimiento de lisis. Enfriar las células en hielo y añadir 10 mM de MgCl 2, 40 U / ml de DNasa A y se incuba durante 60 min a 37 ° C Se preparan soluciones de 80%, 50%, 20% de sacarosa (w / v) en PBS pH 7,4 (10 ml cada uno). Preparar el gradiente de sacarosa en un tubo Falcon de 15 ml, comenzando con 2 ml de sacarosa 80%, seguido por 50% y 20%. Vierta lentamente la pendiente y tenga cuidado de no molestar a las capas ya derramado. Capa del lisado digerido en la parte superior del gradiente y se centrifuga durante 15 min a 1000 xg a 4 ° C. Recoger cuidadosamente la interfase entre la capa de sacarosa al 50-80% con una pipeta y se mezcla con 5 volúmenes de PBS pH 7,4. Centrifugar durante 15 min a 1000 xg a 4 ° C. Repetir el lavado dos veces más. En esta interfase, aggresomes son fluorescentes y pueden ser visualizadas en un microscopio bajo luz UV. Eliminar el sobrenadante yresuspender el precipitado en 250-500 l de PBS pH 7,4. Esta pastilla contiene la aggresomes purificado (Figura 2). 3. El tratamiento de los receptores SH-SY5Y células con mRFP/eGFP-DISC1 Aggresomes Seed 5 x 10 4 receptores células SH-SY5Y de neuroblastoma humano que expresan constitutivamente GFP-DISC1 (598-854) en cubreobjetos de vidrio estériles en cada pocillo de una placa de 24 pocillos. SH-SY5Y células se cultivan en DMEM/F-12 medio suplementado con penicilina / estreptomicina, no aminoácidos esenciales (NEAA) y FBS 10%. 24 horas más tarde, se añaden 10 l a cada pocillo e incubar durante 48-72 horas. Lavar las células 3 x con PBS pH 7,4 y apagar la fluorescencia extracelular con Trypan Blue 0,04% durante 5 min. Fijar las células con PFA al 4% en PBS pH 7,4 durante 10 min en hielo, lavar una vez con H 2 O estéril y montar los cubreobjetos sobre el portaobjetos de vidrio con ProLong oro con DAPI medio de montaje (Invitrogen, EE.UU.). Confirme la absorción /invasión de aggresomes exógenamente aplicadas por colocalización con proteínas de contratación expresadas por las células receptoras en Z-stack imágenes. Sin embargo, la absorción / invasión de proteína exógena no se podría detectar esencialmente en paralelo con el reclutamiento de proteínas de la célula huésped. En nuestro ejemplo mRFP-etiquetados DISC1 aggresomes recluta soluble GFP-etiquetados DISC1 (598-854) proteína expresada por la célula huésped (ver Figura 3). Las fotografías fueron tomadas en un Zeiss LSM 510 confocal o un microscopio Zeiss Axiovision Apotome2. 4. Generación de DISC1 recombinante (598-785) En una publicación anterior se analizó la capacidad de varios fragmentos de la proteína DISC1 a la libre interacción basado en la presencia de dominios de asociación libre. Entre todos los fragmentos de proteína probado humana DISC1 (598-785) que se muestra la propensión fuerte multimerización 4 (Figura 4). Por lo tanto, humana DISC1 (598 a 785) se clonó en pET15b (nvagen, Madison, Wisconsin) que contiene un 6-histidina N-terminal, expresada en E. coli BL21-(lDE3) Rosetta (Novagen, EE.UU.), y se purificó en condiciones desnaturalizantes en 8 mol / l de urea como se ha descrito 4. En resumen, el protocolo se describe a continuación. BL21-(IDE3) Rosetta E. coli se cultivaron en 2 x 500 ml 2YT que contiene 5 mM-arginina-HCl, 5 mM de MgSO4, 100 g / carbencillin ml, 35 mg / ml de cloramfenicol hasta una DO 600: 0.6-0.8 y DISC1 (598-785) se indujo la expresión con IPTG 1 mM. DISC1 (598-785) se expresó durante 4 horas a 37 ° C, la expresión se terminó mediante la recolección de las bacterias por centrifugación. El sedimento bacteriano se resuspendió en 50 ml de tampón TE (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 5 mM EDTA) más 2 mM PMSF, 1% TX-100, 250 ug / ml de lisozima, 20 mM MgCl 2 y 400 U/50 ml DNasa I. Para asegurar la lisis completa, la reacción se incubó durante 30 min a TA con agitación suave. Añadir 10 mM β-mercaptooethanol (ME) y 500 mM NaCl y se incuba durante otros 30 min. Decantar cuerpos bacterianos de inclusión a 20,000 g durante 30 min a 4 ° C. Resuspender el sedimento en 50 ml de tampón de extracción que contiene 50 mM Tris pH 8,0, 5 mM imidazol, 500 mM NaCl, 8 M de urea y 10 mM β-ME y eliminar los restos por centrifugación a 20,000 g durante 30 min a 4 ° C. Lavar el Ni-NTA agarosa matriz con tampón de extracción. Incubar el extracto resuspendido, proteína precleared con matriz de Ni-NTA durante 2 horas a RT. Lavar la matriz de Ni-NTA con tampón de extracción que contiene 12 mM de imidazol. Eluir la proteína lentamente con 15 ml de tampón de elución que contiene 50 mM Tris, 500 mM NaCl, 300 mM imidazol, 8 M urea, 1 mM PMSF, 5 mM EDTA y 10 mM β-ME. Dializar la proteína por pasos a PBS pH 7,4 que contiene 10 mM β-ME. De 1 L cultivo bacteriano de partida, es posible aislar de hasta 50 mg de proteína de DISC1 (598-785) protEIN. α-sinucleína replegamiento Para experimentos con α-sinucleína, 500 ug de la proteína recombinante (Sigma-Aldrich, EE.UU.) se disolvió en PBS a una concentración de 1 mg / ml. Para obtener oligómeros, replegamiento se realizó durante la noche a 37 ° C como se describe en una publicación anterior 10. 5. Etiquetado de DISC1 recombinante (598-785) con DyLight594 Antes del proceso de etiquetado posterior, DISC1 (598-785) de proteínas tiene el ser liberado de β-ME. Por lo tanto, la proteína se dializó 3 veces con PBS pH 7,4 a una dilución de 1:2,000. Etiqueta de 1 mg DISC1 (598-785) con DyLight 594 maleimida (Thermo Scientific, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. En resumen, se disuelve 1 mg / ml de proteína en PBS pH 7,4 y añadir 5 mM TCEP para recuperar los grupos tiol libres. Añadir 20 l de DMF disuelve el colorante a la reacción y se incuba durante 2 horas a RT. Dializar la proteína 3 x PBS a pH7,4 en una proporción de 1:2000 durante 2 horas cada una. Para aumentar aún más la pureza de la proteína marcada una 6-Su etiquetados afinidad basada en la purificación en una columna de Ni-NTA se realiza. Lavar 1 ml de Ni-NTA matriz (Qiagen, Alemania) con 10 ml de PBS pH 7,4. Aplique el etiquetado, la proteína dializada a la columna y se deja correr por la columna lentamente. Lávese la proteína con 3 x 20 ml de PBS pH 7,4 Se eluye la proteína con PBS pH 7,4, 500 mM de imidazol gota a gota mientras se monitoriza la banda de color en la columna de Ni-NTA para reducir el volumen eluido. Dializar el eluato 3 x a 10 mM NaPi pH 7,4 a una dilución de 1:2000 durante 2 horas cada una. Utilice una jeringa estéril de 0,45 micras filtro para filtrar el eluato, la alícuota en 5 x 100 muestras mu l y congelamiento rápido en nitrógeno líquido. La cantidad total de proteínas debe ser 0,5 a 1 mg / ml en cada alícuota de 100 l. opcional concentración paso Para las inyecciones de rata estereotácticos, la proteína se concentró 10 veces en un Speed-Vac (concentrador de Eppendorf 5301). La condición de tampón final fue de 100 mM NaPi. α-sinucleína Etiquetado El etiquetado y la purificación (columna de Ni-NTA) del recombinante α-sinucleína se realizó en paralelo a DISC1 (598-785). El material de partida total fue de 500 mg en vez de 1 mg por DISC1 (598-785). 6. El tratamiento de los receptores SH-SY5Y células recombinante marcado con DISC1 (598-785) Proteínas Semillas 5×10 4 receptores células SH-SY5Y de neuroblastoma humano que expresan constitutivamente GFP-DISC1 (598-854) en cubreobjetos de vidrio estériles en cada pocillo de una placa de 24 pocillos. Añadir proteína marcada al medio de cultivo celular a una concentración de 5-10 mg / ml y se incuba durante 48-72 h. Lavar las células 3 x con PBS pH 7,4 y apagar extracciónfluorescencia ellular con Trypan Blue 0,04% durante 5 min. Fijar las células con PFA al 4% en PBS pH 7,4 durante 10 min en hielo, lavar una vez con H 2 O estéril y montar los cubreobjetos sobre el portaobjetos de vidrio con ProLong oro con DAPI medio de montaje (Invitrogen, EE.UU.). Confirme la captación / invasión de exógenamente aplicado proteína recombinante por colocalización con proteínas de contratación expresadas por las células receptoras en Z-stack imágenes generadas por microscopía confocal de barrido láser. Sin embargo, el reclutamiento de la proteína endógena no puede ser detectado esencialmente en paralelo con la invasión de la proteína de la célula huésped, Z-Stack imágenes todavía puede confirmar la naturaleza invasiva de la proteína. En nuestro ejemplo rec. DISC1 (598-785) * al menos en parte reclutas soluble GFP-etiquetados DISC1 (598-854) la proteína expresada por la célula huésped (ver Figura 5). Para recombinante invasión α-sinucleína pero el reclutamiento no se muestra (Figura 5 B). Se tomaron fotosen un Zeiss LSM 510 confocal-o un microscopio Zeiss Axiovision Apotome2. La inyección del concentrado (ca. 4 l de 2,5 g / l), con la etiqueta DISC1 (598-785) * en los resultados mPFC en la difusión de la proteína alrededor del sitio de inyección que se puede detectar incluso después de la perfusión de los animales con 4% de PFA en PBS pH 7,4 con un Filterset rodamina. En nuestro ejemplo DISC1 (598 a 785) es tomada por un número distinto de neuronas y pueden ser controlados con Z-pila de imágenes (Figura 6). En general, la inyección de otras proteínas después los utiliza aquí no conducen necesariamente a la celda a la invasión. El evento de invasión es esencialmente dependiente de la naturaleza de la proteína, sin embargo una purificación limpia es un requisito previo para su posterior análisis. 7. Los resultados representativos Aggresomes consistentes recombinante FL DISC1-eGFP purificada a partir de células del FLN invadido destinatario SH-SY5Y ceLLS a la baja eficiencia (aproximadamente 0,3% 5) como se ve por colocalización con microscopía confocal (Figura 3). Como se informó anteriormente, DISC1 (598 a 785) expresada y purificada a partir de E. coli forman multímeros 4 fueron igualmente invasor de células con una eficiencia de aproximadamente 20% 5 (Figura 5A) similar a la de α-sinucleína que se usó en paralelo como control positivo (Figura 5B). DISC1 recombinante marcado (598 a 785) expresada y purificada a partir de E. coli fue también invasor de células de neuronas in vivo cuando la proteína multimérica se inyectaron estereotácticamente en la corteza prefrontal medial de la rata (Figura 6; Pum, Bader, Huston, Korth, no publicado). Figura 1. Células de neuroblastoma que expresan transitoriamente FNL FP-DISC1 (rojo). Red aggresomes fluorescentes pueden ser deteCTED dentro de las células. Figura 2. Purificada mRFP-etiquetados DISC1 aggresomes después de la purificación en un gradiente de sacarosa. Figura 3. Imagen fluorescente de aggresomes invadidas. mRFP-etiquetados flDISC1 aggresomes se purificaron y se incubaron con células de neuroblastoma SH-SY5Y que sobreexpresan GFP-etiquetados soluble DISC1 (598-854). Una absorción de aggresomes marcados se monitoriza mediante formación de imágenes pila Z en un microscopio láser-Scan (Zeiss LSM 510). Figura 4. SEC-perfil de rec. DISC1 (598-785) que contiene el S704 y C704 los polimorfismos de nucleótido único (SNP). Ambas variantes muestran una interrupción de oligomerización ordenada y la formación de mult de alto peso molecularIMers (flecha roja). Este cuadro se modifica a partir de la publicación de Leliveld et al., Biochemistry, 2009. Figura 5. Fluorescente Z-stack de imagen invasivas DyLight marcado DISC1 recombinante (598-785). SH-SY5Y neuroblastoma células que expresan GFP-soluble DISC1 (598-854) se incubaron con la etiqueta, la proteína recombinante a una concentración de 5 mg / ml. (A) los agregados roja muestra la invasión de rec. DISC1 (598-785) de proteínas y puntos amarillos indican una selección de soluble GFP-DISC1 (598-854) en agregados. (B) recombinante α-sinucleína (rojo) invade las células sin la contratación con una frecuencia de aproximadamente 20%. Haga clic aquí para ampliar la cifra . Figura 6. Inmunofluorescente de imageninyecta el etiquetado, DISC1 recombinante (598-785) de proteínas. Z-stack de imágenes confirma la presencia de rec. DISC1 (598-785) de proteínas en las neuronas corticales de rata teñidas con un anticuerpo contra núcleos neuronales (NeuN, verde).