Målet är att övervaka den mitokondriella redoxtillstånd av isolerade hjärtan inom ramen för fysiologiska preload och tryck afterload. En biventrikulär arbetar kaninhjärta modell presenteras. Hög upplösning Spatiotemporal fluorescensavbildning av NADH används för att övervaka den mitokondriella redoxtillstånd av epikardial vävnad.
Sedan starten av Langendorff 1, förblir isolerat perfunderade hjärtat en framstående verktyg för att studera hjärtats fysiologi 2. Det är dock inte väl lämpade för studier av hjärt-metabolism, som kräver att hjärtat att utföra arbete inom ramen för fysiologiska preload och tryck afterload. Neely infördes ändringar i Langendorff tekniken att upprätta lämpliga vänster kammares (LV) preload och tryck afterload 3. Modellen är känd som det isolerade LV arbetande hjärta modell och har använts i stor utsträckning för att studera prestandan LV och metabolism 4-6. Denna modell är emellertid inte tillhandahåller en korrekt laddad högra ventrikeln (RV). Demmy et al. första rapporterade en biventrikulär modell som en modifiering av LV arbetande hjärtat modell 7, 8. De fann att slagvolymen, hjärtminutvolym och tryck utveckling förbättras i hjärtat omvandlats från att arbeta LV läge till biventrikulär arbetsläge 8 </sup>. En korrekt lastad RV minskar också onormala tryckgradienter över septum för att förbättra septal fungera. Biventrikulär arbetande hjärtan har visat att upprätthålla aorta utgång, pulmonell flöde, menar aorta tryck, hjärtfrekvens och myokardiala ATP nivåer för upp till 3 timmar 8.
När man studerar de metaboliska effekterna av myokardial skada, såsom ischemi, är det ofta nödvändigt att identifiera platsen för den påverkade vävnaden. Detta kan göras genom avbildning av fluorescens av NADH (den reducerade formen av nikotinamidadenindinukleotid) 9-11, funnet ett koenzym i stora mängder i mitokondrierna. NADH fluorescens (fNADH) visar en nära linjärt omvänt förhållande med lokala syrekoncentrationen 12 och tillhandahåller ett mått på mitokondriell redoxtillstånd 13. fNADH avbildning under hypoxiska och ischemisk förhållanden har använts som en dye-fri metod för att identifiera hypoxiska regioner 14, 15 och övervaka utvecklingen avhypoxiska förhållanden över tiden 10.
Syftet med metoden är att övervaka den mitokondriella redoxtillstånd av biventrikulär arbetande hjärtan under protokoll som förändrar graden av myocyt metabolism eller inducera hypoxi eller skapa en kombination av båda. Hjärtan från nyzeeländska vita kaniner var anslutna till en biventrikulär arbetar hjärtsystem (Hugo Sachs Elektronik) och perfuserades med modifierad Krebs-Henseleit-lösning 16 vid 37 ° C. Aorta, LV, lungartären och vänster och höger förmaks tryck har registrerats. Elektrisk aktivitet mättes med användning av en monofasisk elektrod aktionspotential. Att avbilda fNADH tillsattes ljus från en kvicksilverlampa filtrerades (350 ± 25 nm) och används för att belysa epikardium. Emitterat ljus filtrerades (460 ± 20 nm) och avbildades med användning av en CCD-kamera. Förändringar i epikardiella fNADH av biventrikulär arbetande hjärtan under olika stimuleringsfrekvenser presenteras. Kombinationen av hjärtat modellen och fNADH avbildningtillhandahåller en ny och värdefull experimentella verktyg för att studera akuta hjärtsjukdomar patologier i samband med realistiska fysiologiska betingelser.
Den isolerade Langendorff perfunderade hjärtat fortfarande ett framstående verktyg för att studera hjärtats fysiologi 2. Det är speciellt användbart i studier av hjärtarytmier, i synnerhet de som använder fluorescerande avbildning av transmembranpotentialen 20. En fördel är att hela epikardium hos det isolerade hjärtat kan observeras 21, 22. En annan fördel är att, i motsats till blod, inte perfusion med en klar kristalloid buffertlösning inte störa fluorescenssignaler. En begränsning är att Langendorff tekniken inte är väl lämpad för studier av hjärt-metabolism, som ofta kräver hjärtat att utföra arbete inom ramen för fysiologiska preload och tryck afterload.
Att höja relevansen av isolerade hjärta förberedelserna för metaboliska studier, Neely infördes ändringar i Langendorff tekniken för att fastställa lämpliga vänster kammares (LV) preload och tryck afterload 3.Modellen är känd som det isolerade LV arbetande hjärta modell och har använts i stor utsträckning för att studera prestandan LV och metabolism 4-6. LV arbetar hjärtat modell är överlägsen den Langendorff modell för funktionella utvärderingar, men det ger inte en rätt placerat höger kammare (RV). Demmy et al. första rapporterade en biventrikulär modell (LV & RV) som en modifiering av LV arbetande hjärtat modell 7, 8. De fann att slagvolymen, hjärtminutvolym och tryck utveckling förbättras i hjärtat omvandlats från att arbeta LV läge till biventrikulär arbetsläge 8. En korrekt lastad RV förbättrar också septal funktion genom att minska onormala tryckgradienter över septum. Biventrikulär arbetande hjärtan har visat att upprätthålla aorta utgång, pulmonell flöde, menar aortatrycket, genomsnittliga pulmonella tryck, hjärtfrekvens och myokardiell ATP och kreatin fosfat i upp till 3 timmar 8. Biventrikulär arbetar hjärta studier använder oftast hjärtan frOm-små djur, såsom råttor och kaniner, eftersom hjärtminutvolym och den erforderliga volymen av perfusatet är mycket mindre än den för hjärtan större djur. Har dock biventrikulära arbetar hjärta studier genomförts med hjälp hjärtan från svin, hörntänder och till och med människor 23, 24.
Den metaboliska efterfrågan på isolerade hjärtan i biventrikulär arbetsläge är betydligt högre än Langendorff perfusion. Det är viktigt att perfusatet lösning tillhandahålla tillräckligt med syre och metaboliskt substrat för att stödja biventrikulär hjärtfunktionen. Standardmetoder kristalloida buffertlösningar, såsom Krebs-Henseleit-16, 17, 25 eller Tyrodes 26, 27, har syre lösligheter så hög som 5,6 mg / L. När dessa lösningar gasades med karbogen (en gasblandning av 95% O2 och 5% CO2) och innehåller lämpliga metaboliska substrat (glukos, dextros och / eller natrium-pyruvat), är de lämpliga för biventrikulära arbetande hjärtan slår på normenal sinus priser ca 180 bpm för en kanin).
Metabola efterfrågan ökar för snabba rytmer och mängden syre löst i vanliga perfusat kanske inte tillräckligt för att fullt ut stödja en biventrikulär arbetar hjärta som är upphandlande vid höga hastigheter. Kristalloida buffertlösningar innehållande erytrocyter eller blandade med helblod har använts i arbets hj förberedelser för att säkerställa tillräcklig syretillgång. Tidigare studier har visat att tillsats av erytrocyter till en Krebs-Henseleit-lösning förbättrad arbetsmiljö hjärtfunktionen under rigorösa stimulerings-protokoll och också minskat förekomsten av kammarflimmer 16. En begränsning av användning av erytrocyter eller blandningar av helblod är att hemoglobin stör ljusvåglängder som används för fluorescensavbildning 13. Andra substrat, såsom albumin, kan också läggas till perfusatet lösningar för att förlänga hjärtats livskraft och minska ödem 28.
Under fluorescensavbildning intensitet excitationsljuset bör vara hög och ljusfördelning bör vara enhetliga. Åstadkomma enhetlig belysning är inte alltid lätt på grund av krökningen av den epikardiella ytan. I våra studier har vi bilden fNADH genom att filtrera ljus (350 ± 25 nm) från en kvicksilverlampa. En förgrenad fiberoptisk ljusledare används för att rikta UV-ljus på den epikardiella ytan. Likformig belysning kan åstadkommas genom lämplig placering av två utgående hylsorna. UV LED ljuskällor också skulle kunna användas, såsom vi har visat i figur 3. LED källorna är relativt billiga så multipla källor kunna inkorporeras i ett avbildningssystem. LED kan också cykla på och av vid höga hastigheter för att synkronisera exciteringsljus med bild förvärvet.
Fotoblekning av NADH bör minimeras 29 genom att minska tiden för vävnaden belysning. Detta kan göras genom att cykla belysningen till och från med en elektronic slutare och en lampa eller med ett LED-belysning och en styrenhet. Om belysningen är synkroniserad med hjärtcykeln så fNADH bildinsamlande kan vara begränsad till diastol, vilket skulle reducera rörelseartefakt i de fluorescerande signalerna. Triggade belysning och bildinsamlande med användning av en trycksignal, såsom LV-tryck, skulle vara ett sätt att göra detta.
I våra studier har vi observerat att förändringar i fNADH per tidsenhet kan vara mer än 5 gånger högre vid 400 bpm än 200 bpm. Detta tyder på att snabba rytmer höja redox tillstånd hjärtat. Huruvida detta beror på hypoxi eller oförmåga myocyter att oxidera NADH till NAD + tillräckligt snabbt för att undvika ansamling av NADH är fortfarande en obesvarad fråga.
Prestandan hos en biventrikulär arbeta hjärta förberedelser är knuten till flera faktorer. En av de viktigaste är att fastställa lämpliga preload och afterload tryck att efterlikna den fysiologiskavillkor som är under utredning. I synnerhet måste LV afterload (aorta-tryck) justeras för att representera systemiskt tryck. Om den är alltför hög kommer LV inte att kunna övervinna trycket, vilket resulterar i reflux. Tryck som är för låg kommer att negativt påverka koronar genomblödning. LV förspänning trycket (till vänster förmak tryck) bör också justeras för att ge ett slut diastoliska volym som är lämplig för det experimentella protokollet.
fNADH avbildning av levande vävnad är en etablerad läge för fluorescensavbildning 13. Dess tillämpning på hjärtvävnad illustrerades av Barlow och Chance när de rapporterade slående förhöjda fNADH inom regionalt ischemisk vävnad efter ligering av ett kranskärl 14. Deras fNADH bilder registrerades på film med hjälp av en Fairchild oscilloskop kamera och UV fotografering med blixt. Coremans et al. expanderat på detta koncept med NADH fluorescensen / UV reflektans förhållande till mätE metaboliska tillståndet för epikardium för Langendorff blod-perfuserade råtthjärtan 30. En videofluorimeter användes för avbildning och data registrerades med användning av en videobandspelare. Senare, Scholz et al. används en spektrograf och fotodioduppsättningen att mäta genomsnittlig fNADH från ett stort område av LV. Detta tillvägagångssätt minskade effekterna av epikardiella fluorescens heterogeniteter och lokala variationer i omlopp samtidigt avslöja makroskopiska arbetsrelaterade varianter av fNADH 31. Detta tillvägagångssätt är liknar beräkningen av den genomsnittliga fNADH nivåer för en region av intresse i alla ramarna i en fNADH avbildning datamängd, som illustreras i figur 2. Som vi har presenterat i denna artikel ger dagens teknik med hög hastighet CCD-kameror och digitalt styrd hög effekt UV spotlights. Tekniken gör det möjligt Spatiotemporal dynamiken i fNADH och hjärt-metabolism kan studeras ur många nya perspektiv. Den relativt låga kostnaden för optik och ljuskällor gör att fNADH avbildning ett användbart tillbehör för konventionella hjärt optiska kartläggning. 9, 32
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av ett bidrag från NIH (R01-HL095828 till MW Kay).
Chemical | Company | Catalogue Number |
NaCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S-3014 |
KCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | P3911-500G |
CaCl2 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | C77-500 |
MgSO4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | M-7506 |
NaHCO3 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | S-233 |
KH2PO4 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | 423-316 |
Glucose | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 158968-500G |
NaPyruvate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | P2256-25G |
Albumin | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A9418-100G |