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Medicina

पृथक बाइवेन्ट्रिकुलर NADH प्रतिदीप्ति इमेजिंग कार्य खरगोश दिल

Published: July 24, 2012
doi:
10.3791/4115
, , , ,
1Electrical and Computer Engineering Department,The George Washington University, 2Pharmacology and Physiology Department,The George Washington University

Summary

उद्देश्य के लिए शारीरिक प्रीलोड और afterload दबाव के के संदर्भ में पृथक दिल की mitochondrial redox राज्य की निगरानी है. एक बाइवेन्ट्रिकुलर काम खरगोश दिल मॉडल प्रस्तुत किया है. उच्च spatiotemporal NADH संकल्प प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए epicardial ऊतक के mitochondrial redox राज्य की निगरानी के लिए प्रयोग किया जाता है.

Abstract

Since its inception by Langendorff1, the isolated perfused heart remains a prominent tool for studying cardiac physiology2. However, it is not well-suited for studies of cardiac metabolism, which require the heart to perform work within the context of physiologic preload and afterload pressures. Neely introduced modifications to the Langendorff technique to establish appropriate left ventricular (LV) preload and afterload pressures3. The model is known as the isolated LV working heart model and has been used extensively to study LV performance and metabolism4-6. This model, however, does not provide a properly loaded right ventricle (RV). Demmy et al. first reported a biventricular model as a modification of the LV working heart model7, 8. They found that stroke volume, cardiac output, and pressure development improved in hearts converted from working LV mode to biventricular working mode8. A properly loaded RV also diminishes abnormal pressure gradients across the septum to improve septal function. Biventricular working hearts have been shown to maintain aortic output, pulmonary flow, mean aortic pressure, heart rate, and myocardial ATP levels for up to 3 hours8.

When studying the metabolic effects of myocardial injury, such as ischemia, it is often necessary to identify the location of the affected tissue. This can be done by imaging the fluorescence of NADH (the reduced form of nicotinamide adenine dinucleotide)9-11, a coenzyme found in large quantities in the mitochondria. NADH fluorescence (fNADH) displays a near linearly inverse relationship with local oxygen concentration12 and provides a measure of mitochondrial redox state13. fNADH imaging during hypoxic and ischemic conditions has been used as a dye-free method to identify hypoxic regions14, 15 and to monitor the progression of hypoxic conditions over time10.

The objective of the method is to monitor the mitochondrial redox state of biventricular working hearts during protocols that alter the rate of myocyte metabolism or induce hypoxia or create a combination of the two. Hearts from New Zealand white rabbits were connected to a biventricular working heart system (Hugo Sachs Elektronik) and perfused with modified Krebs-Henseleit solution16 at 37 °C. Aortic, LV, pulmonary artery, and left & right atrial pressures were recorded. Electrical activity was measured using a monophasic action potential electrode. To image fNADH, light from a mercury lamp was filtered (350±25 nm) and used to illuminate the epicardium. Emitted light was filtered (460±20 nm) and imaged using a CCD camera. Changes in the epicardial fNADH of biventricular working hearts during different pacing rates are presented. The combination of the heart model and fNADH imaging provides a new and valuable experimental tool for studying acute cardiac pathologies within the context of realistic physiological conditions.

Protocol

1. अध्ययन के लिए सेट 118, NaCl KCl 3.30, 2.00 2 CaCl, 1.20 4 MgSO, 24.0 3 NaHCO, 1.20 के.एच. 2 4 पीओ, 10.0 ग्लूकोज, 2.00 NaPyruvate के, और 20.0 मिलीग्राम / एल albumin: संशोधित क्रेब्स – Henseleit 16 समाधान के चार लीटर (मिमी में तैयार ). समाधान संभव के रूप में प्रयोग की शुरुआत के करीब के रूप में तैयार किया जाना चाहिए. बाँझ फ़िल्टरिंग (22 माइक्रोन, Corning ध्यान में लीन होना आकार) के बाद 7.4 पीएच समायोजित किया जाना चाहिए. समाधान osmolality / mOsm किग्रा 275 और 295 के बीच होना चाहिए. शुद्ध पानी के साथ काम कर हृदय प्रणाली के सभी ट्यूबों और कक्षों कुल्ला. पंप चलाएँ जब तक सब पानी प्रणाली से हटा दिया गया है. छिड़काव पंपों (Langendorff छिड़काव पंप, बाएँ दिल छिड़काव पंप, और सही दिल छिड़काव पंप) में से प्रत्येक के साथ कतार में: सेलूलोज़ झिल्ली फिल्टर (5 माइक्रोन, Advantec ध्यान में लीन होना आकार) जोड़ें. प्रत्येक दबाव संवेदक के लिए एक दो बिंदु (0 और 60 mmHg) अंशांकन प्रदर्शन करते हैं. पानी स्नान पर बारी. एक गर्म पानी के स्नान (कोल पामर) परिसंचारी पानी तख्ताबंदीवाला ट्यूबों और हीट एक्सचेंजर्स गर्म करने के लिए प्रयोग किया जाता है. Perfusate है एक अलग पानी स्नान (Oakton उपकरण) में पूर्व – गरम. दोनों स्नान करने के लिए 37 ° सी. के एक समाधान का तापमान बनाए रखने के लिए सेट कर रहे हैं पंप पर बारी एक संवृत पाश में perfusate प्रसारित. Perfusate microfiber (hemofilters) oxygenators 95 2 हे और 80 kPa में 5% सीओ 2% के साथ मार डाला के माध्यम से गुजरता है. Oxygenated perfusate तो हीट एक्सचेंजर्स के माध्यम से बहती है दिल cannulae में प्रवेश करने से पहले 37 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर इसे बनाए रखने. 2. दिल छांटना काम दिल प्रणाली स्थापित करने के लिए लगातार दबाव Langendorff मोड में संचालित द्वारा शुरू करो. 50-60 mmHg की रेंज भीतर महाधमनी ब्लॉक के दबाव सेट. (44 मिलीग्राम / किलोग्राम) ketamine और xylazine के (10 मिलीग्राम / किग्रा) के एक intramuscular इंजेक्शन के साथ खरगोश असंवेदनता उत्पन्न करना. बाद खरगोश बेहोश, pentobarbital (50 मिलीग्राम / कश्मीरछ) और हेपरिन (2000 यू) नसों के सीमांत कान या पिछले अंग के अंदर पर पार्श्व saphenous नस नस के माध्यम से इंजेक्शन है. जब खरगोश पूरी तरह से गैर जिम्मेदार है, के रूप में दर्द पलटा की कमी से निर्धारित वक्ष गुहा जल्दी से खोला है, पेरीकार्डियम कटा हुआ है, महाधमनी clamped, है और दिल और फेफड़ों excised हैं. इस बिंदु पर फेफड़ों दिल को नहीं छोड़ा जा सकता जुड़ा होना चाहिए फुफ्फुसीय नसों को अलग करने के साथ मदद करने के लिए. 5 मिमी व्यास प्रवेशनी है कि एक 60 एमएल perfusate और हेपरिन की 200 इकाइयों से भरा सिरिंज से जुड़ा हुआ है के साथ अलग करने और महाधमनी cannulate. आकार शून्य रेशम सीवन साथ प्रवेशनी के महाधमनी सुरक्षित और धीरे धीरे खून के दिल फ्लश करने के लिए सिरिंज दबाना. 3. बाइवेन्ट्रिकुलर केन्युलेशन काम कर हृदय प्रणाली की महाधमनी ब्लॉक करने के लिए दिल से कनेक्ट करें. महाधमनी, जो कोरोनरी emboli पैदा कर सकता है में प्रवेश करने से हवा को रोकने. यह सबसे अच्छा है महाधमनी बीएल प्रवेशनी देतेमहाधमनी संबंधक एक तिरछा कोण पर आ रहा है और perfusate धीरे प्रवेशनी में संबंधक से ड्रिप जबकि यह जुड़ा हुआ है की अनुमति द्वारा ock. जबकि दिल लगातार दबाव Langendorff मोड में में perfused है, वसा और संयोजी ऊतक को हटाने और निम्नलिखित वाहिकाओं का पता लगाने के अवर और बेहतर रग Cava, अकेले उत्पन्न होने वाला, जोड़ों में नहीं नस, फुफ्फुसीय धमनी, फुफ्फुसीय नसों. बेहतर रग Cava कटी घमनी को बांधना. फुफ्फुसीय धमनी बस नीचे कट सही है और छोड़ दिया फुफ्फुसीय धमनियों जहां शाखाओं. दिल और फेफड़े और उन सभी को कटी घमनी को बांधना एक सीवन का उपयोग कर के बीच सभी शेष वाहिकाओं (फुफ्फुसीय नसों) समूह फेफड़ों निकालें. बाएं आलिंद उपांग के कोने में एक छोटा सा छेद कट. सुनिश्चित करें कि ला perfusate से भर जाता है. ला Cannulate जबकि यह सुनिश्चित करना कि प्रवेशनी पूरी तरह perfusate साथ भरा है, जबकि यह डाला जाता है. ला उपांग प्रवेशनी सीवन. बाईं ओर पंप (# 2 पंप) पर बारी करने के लिए टी के लिए प्रवाह प्रदानवह आलिंद छोड़ दिया. 6 mmHg और समायोजित ± 2 mmHg के रूप में atrial फैलाव द्वारा निर्धारित – 2 के बीच प्रीलोड दबाव सेट. बंद Langendorff पंप (# 1 पंप) बदल कर काम कर दिल मोड में दिल का स्विच. क्षण भर के 10 mmHg के लिए महाधमनी दबाव कम होती है और फिर धीरे धीरे 80-100 mmHg की सीमा के भीतर करने के लिए यह वृद्धि. यह महाधमनी वाल्व खोलने और के रूप में से कार्य यह सामान्य शारीरिक शर्तों के दौरान की अनुमति देगा. अंतिम afterload दबाव एल.वी. का सिकुड़ना पर निर्भर करेगा. यह एक मूल्य है कि लगभग 20 mmHg शिखर एल.वी. दबाव की तुलना में कम है के लिए सेट किया जाना चाहिए. एल.वी. कार्डियक आउटपुट perfusate महाधमनी ब्लॉक (एमएल / मिनट) बाहर निकलने के प्रवाह की दर को मापने के द्वारा निर्धारित किया जा सकता है. सामान्य कार्डियक आउटपुट है 14.77 और 16.43 के बीच शरीर वजन 17 के 100 ग्राम और औसत प्रति मिनट / एमएल 340 एमएल / 2.2 किलो खरगोश के लिए न्यूनतम. महाधमनी दबाव चित्र 1 में दिखाया संकेत सदृश चाहिए. मैं के माध्यम से आरए Cannulatenferior रग Cava. सुनिश्चित करें कि दोनों आरए और प्रवेशनी पूरी तरह से perfusate से भर रहे हैं और प्रवेशनी डालने जबकि हवा के बुलबुले के गठन को रोकने. नस के लिए प्रवेशनी सिवनी. दाईं ओर पंप (# पंप 3) सही atrium प्रवाह प्रदान पर बारी. लगभग 3 mmHg के लिए दबाव सेट. सुनिश्चित करें कि आर.वी. perfusate से भर जाता है और फुफ्फुसीय धमनी cannulate. सुनिश्चित करें कि प्रवेशनी पूरी तरह perfusate साथ भरा है, जबकि यह हवाई बुलबुले को रोकने के लिए डाला जाता है. फुफ्फुसीय धमनी प्रवेशनी सीवन. 4. सिग्नल अधिग्रहण: दबाव, monophasic कार्रवाई क्षमता, और fNADH एक बार बाइवेन्ट्रिकुलर केन्युलेशन पूरा हो गया है, ध्यान से महाधमनी में महाधमनी प्रवेशनी के माध्यम से दबाव transducer कैथेटर (मिलर) सम्मिलित है. धीरे यह महाधमनी वाल्व अतीत और एल.वी. में नेविगेट. एल.वी. दबाव संकेत मॉनिटर कैथेटर टिप की उचित स्थिति सुनिश्चित करने के लिए. एल.वी. दबाव का एक उदाहरण दिखाया गया हैचित्र 1 में. धीरे निलय epicardium के खिलाफ monophasic कार्रवाई संभावित इलेक्ट्रोड दबाएँ. उचित कार्रवाई संभावित माप को प्राप्त करने के लिए संकेत मॉनिटर. संकेत में थोड़ा सा गति विरूपण साक्ष्य सामान्य है. एक द्विध्रुवी प्रोत्साहन इलेक्ट्रोड सही दिल गति atrium पर रखें. हमारे प्रोटोकॉल में, दिल चक्र लंबाई, 300 और 150 मिसे के बीच 200 और 400 bpm से संबंधित है, क्रमशः पर पुस्तक थे. एल.वी. epicardial सतह के तापमान को मापने. यदि अध्ययन की आवश्यकता है कि तापमान 37 पर बनाए रखा जा डिग्री सेल्सियस तो दिल पानी तख्ताबंदीवाला कक्ष या एक गर्म superfusate स्नान में दिल डूब दिल भर में एक निरंतर तापमान बनाए रखने के अंदर दिल की स्थिति. स्थिति सीसीडी कैमरा (Andor iXon DV860, 128×128 पिक्सेल) और ध्यान केंद्रित लेंस है कि इस तरह देखने के लिए एक उपयुक्त क्षेत्र में मनाया जाता है. कैमरा एक कार्य केंद्र के लिए जुड़ा हुआ है और चित्र 2 fps पर हासिल कर रहे हैं का उपयोग कर Andor Solis softwaफिर से. पारा दीपक प्रकाश पर इमेजिंग की शुरुआत से पहले बारी. प्रकाश एक उत्तेजना फिल्टर (350 ± 25 एनएम, Chroma प्रौद्योगिकी) के माध्यम से निर्देशित है और एक फाइबर ऑप्टिक प्रकाश गाइड (Horiba Jobin Yvon मॉडल +१९५०-1M) में हृदय की सतह रोशन. प्रकाश गाइड के माध्यम से यूवी प्रकाश के छोटे क्षीणन है. पराबैंगनी रोशनी भी एक उच्च शक्ति एलईडी एलईडी spotlights से मिलकर प्रणाली (Mightex PLS-0365-030-एस) और एक नियंत्रण इकाई (Mightex एसएलसी-SA04 – अमेरिका) का उपयोग किया जा सकता है. बंद कमरे में प्रकाश बारी के लिए और किसी भी परिवेश प्रकाश व्यवस्था कम से कम. दिल में प्रकाश गाइड (या एलईडी spotlights) के ferrules लक्ष्य वर्दी epicardial रोशनी को प्राप्त करने के लिए. उत्सर्जित NADH प्रतिदीप्ति (fNADH) के के एक उत्सर्जन फिल्टर (460 ± 20 एनएम Chroma प्रौद्योगिकी) के माध्यम से गुजरता है और सीसीडी कैमरा द्वारा imaged है. इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग ब्याज की एक क्षेत्र का चयन करके मॉनिटर समय पर fNADH परिवर्तन. क्षेत्र ओ भीतर मतलब पिक्सेल तीव्रता पर नजर रखने के लिए जीना अद्यतन मोड का चयन करेंच ब्याज. दिल बाइवेन्ट्रिकुलर काम मोड में कार्य किया जाना चाहिए करने के लिए उचित दबाव उत्पन्न. fNADH स्तर कम और epicardial सतह पर स्थिर होने के लिए पर्याप्त कोरोनरी छिड़काव की पुष्टि करनी चाहिए. अध्ययन में इस बिंदु पर एक विशिष्ट प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल के लिए एक परिकल्पना का परीक्षण करने के लिए लागू किया जाना चाहिए. जब अध्ययन पूरा हो गया है, सिस्टम से दिल को हटाने और सभी perfusate नाली. शुद्ध पानी के साथ सिस्टम टयूबिंग और कक्षों कुल्ला. नियमित रखरखाव के लिए समय – समय पर Mucasol समाधान या एक पतला हाइड्रोजन पेरोक्साइड समाधान, के रूप में की जरूरत के साथ rinsed होना चाहिए. 5. FNADH छवियाँ प्रसंस्करण लाइन बंद NADH डेटासेट की तुलना के लिए एक रास्ता है (fNADH (i, j, टी)) के प्रयोगों के बीच प्रत्येक प्रतिदीप्ति एक संदर्भ छवि का उपयोग कर छवि सामान्य डाटासेट से 9 ((i, j, 0 टी) fNADH), के रूप में नीचे समीकरण में दिखाया . अन्य NADH प्रतिदीप्ति सामान्य pl हैइक्का 9 प्रयोग, 18, ​​19 से पहले देखने के क्षेत्र में एक uranyl कांच के छोटे टुकड़े. Uranyl गिलास (450 – 550 एनएम) प्रतिदीप्ति होगा जब यूवी प्रकाश के लिए एक संकेत है कि एक स्थिर संदर्भ के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है प्रदान के साथ प्रकाशित. 6. प्रतिनिधि परिणाम एक बाइवेन्ट्रिकुलर काम कर खरगोश दिल तैयारी की पूर्वकाल और बेसल दृश्य चित्र 1 में दिखाया जाता है. बाएं निलय दबाव महाधमनी वाल्व अतीत और बाएं वेंट्रिकल में एक दबाव transducer कैथेटर (मिलर SPR-407) नेविगेट द्वारा मापा गया था. महाधमनी, फुफ्फुसीय धमनी, और छोड़ दिया ventricular दबाव (LVP) चित्रा 1C में दिखाया जाता है. Diastolic LVP आमतौर पर 0 के बीच और 10 mmHg. न्यूनतम डायालोस्टिक महाधमनी दबाव लगभग 60 mmHg है. शिखर सिस्टोलिक LVP भरने (प्रीलोड या ला दबाव) दबाव और सिकुड़ना पर निर्भर हैऔर, बेहतर, 80 और 100 mmHg के बीच होना चाहिए. अधिकतम महाधमनी दबाव और अधिकतम LVP बारीकी से मैच, के रूप में चित्रा 1C में दिखाया जाना चाहिए. एक तेजी से विध्रुवण चरण और repolarization के चरण है कि खरगोश के मन के लिए विशिष्ट हैं के साथ monophasic कार्रवाई की क्षमता (एमएपीएस) चित्रा -1 में दिखाया जाता है. नक्शे एक ठेका दिल से किया जा सकता है अपेक्षाकृत आसानी से दर्ज कर सकते हैं, लेकिन आमतौर पर हृत्प्रसार दौरान छोटे गति विरूपण साक्ष्य होगा, के रूप में चित्रा 1D में दिखाया गया है. नक्शे पेसिंग (कब्जा) के दौरान दिल की सफल entrainment की पुष्टि के लिए उपयोगी होते हैं और भी स्थानीय electrophysiological ischemia या अन्य तीव्र perturbations के कारण बदलाव को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. एक ईसीजी भी गर्म superfusate की एक स्नान में submerging दिल और दिल के बाएँ और दाएँ पक्ष पर स्नान में एक इलेक्ट्रोड रखने के द्वारा मापा जा सकता है. एक तिहाई उदासीन इलेक्ट्रोड या तो स्नान में रखा गया है, दिल से दूर, या महाधमनी से जुड़ी है.एक ईसीजी वैश्विक उत्तेजना और repolarization के प्रक्रिया है, जो समग्र बिजली समारोह का मूल्यांकन करने के लिए और ischemia की उपस्थिति का खुलासा करने के लिए उपयोगी है के बारे में जानकारी प्रदान करेगा. fNADH इमेजिंग दिल की mitochondrial redox राज्य में परिवर्तन, जो इस्कीमिक या hypoxic क्षेत्रों के spatiotemporal प्रगति को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है पता चलता है. इस अध्ययन के लिए, epicardial fNADH तीन चक्र (CLS) लंबाई 300 से, 200, और 150 मिसे में पेसिंग दर दौरान redox राज्य में परिवर्तन की निगरानी के लिए मापा गया था. ब्याज की एक क्षेत्र (लाल बॉक्स, चित्रा 2) से औसत fNADH मूल्यों को दिखाने के लिए कि आधारभूत fNADH के स्तर में वृद्धि चक्र लंबाई के रूप में छोटा है. जब दर पेसिंग साइनस लय (सी.एल. = 300 मिसे) आधारभूत fNADH स्तर अपेक्षाकृत स्थिर है के करीब है. चक्र लंबाई के रूप में कम से कम सीएल (150 मिसे) में सबसे बड़ी वृद्धि के साथ 300 मिसे, आधारभूत fNADH के स्तर में वृद्धि के नीचे छोटा है. पूर्ण पूर्वकाल सतह की उच्च संकल्प fNADH इमेजिंग200 और 400 bpm से 3 चित्र में दिखाया जाता है. 200 bpm पर fNADH स्तर निरंतर और spatially सजातीय थे. पर 400 bpm से, fNADH स्तर epicardium भर में काफी वृद्धि हुई है. महत्वपूर्ण स्थानिक विविधता है बड़े आर.वी. और एल.वी. वंशीय क्षेत्रों के भीतर होने वाली वृद्धि के साथ मनाया गया. fNADH संकेत संकुचन (गति विरूपण साक्ष्य) के साथ झूल रहे हैं और दोलन की आवृत्ति दिल की दर (चित्रा 2) से मेल खाती है. Biventricular केन्युलेशन में, दिल के आधार 4 cannulae, जो दिल संकुचन के दौरान झूल से रोकने में मदद करता है के द्वारा आयोजित किया जाता है. इसलिए, दोलन आयाम हमेशा किसी भी लंबे समय (5-10 सेकंड) पैमाने पर fNADH में रुझान है कि ischemia या hypoxia के कारण कर रहे हैं की तुलना में कम है. आकृति 1. ठेठ एक अलग बाइवेन्ट्रिकुलर से और दबाव monophasic कार्रवाई क्षमता आर ए काम करbbit दिल. ए बेसल दिल की चार cannulae दिखा दृश्य:, 2, फुफ्फुसीय धमनी, 1, महाधमनी 3, आलिंद छोड़ दिया है, और 4, सही आलिंद बी दिखा दिल के बाएं वेंट्रिकल (LV) के पूर्वकाल दृष्टिकोण और सही वेंट्रिकल. (आर वी) सी. प्रतिनिधि दबाव. शीर्ष: बाएं निलय (ठोस लाइन) दबाव और महाधमनी दबाव (बिंदीदार रेखा). नीचे: फेफड़े के दबाव डी. प्रतिनिधि monophasic कार्रवाई क्षमता. संकेत पैनल सी. में दिखाया दबाव के साथ गठबंधन किया है बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहाँ क्लिक करें . चित्रा 2. एक अलग खरगोश दिल काम कर बाइवेन्ट्रिकुलर की fNADH इमेजिंग. शीर्ष देखने (बाएं) और तीन fNADH छवियों के क्षेत्र के एक कार्टून दिखाए जाते हैं. इसी पेसिंग चक्र लंबाई (सीएल) प्रत्येक छवि पर संकेत दिया है.वह नीचे के पैनल में fNADH संकेत के लिए ब्याज की क्षेत्र के लाल बॉक्स द्वारा संकेत दिया है. monophasic कार्रवाई संभावित इलेक्ट्रोड की टिप हित के क्षेत्र का सही करने के लिए देखा जाता है. epicardium पारा दीपक और प्रकाश गाइड का उपयोग प्रबुद्ध किया गया था, के रूप में चित्रा 5 में दिखाया गया है. केवल epicardial ब्याज के आसपास के क्षेत्र की सतह के नीचे प्रबुद्ध किया गया था: क्षेत्र के लिए ब्याज की औसत fNADH शीर्ष पैनल में लाल बॉक्स द्वारा संकेत दिया. औसत कम चक्र लम्बाई के साथ fNADH बढ़ जाती है. चित्रा 3. एक अलग काम कर रहे बाइवेन्ट्रिकुलर खरगोश दिल की पूर्ण पूर्वकाल सतह की fNADH छवियों. दिल आरए से 200 bpm से और 400 bpm से पुस्तक थी. मैं fNADH (2 एफपीएस, 0.4 मिमी के एक प्रस्ताव पर 128×128 पिक्सल) imaged किया गया था, जबकि पूरे पूर्वकाल दो उच्च शक्ति एल ई डी (Mightex PLS-0365-030-एस, 365 एनएम, 4% का उपयोग epicardium रोशनntensity, 50 मेगावाट अधिकतम).

Discussion

अलग Langendorff perfused दिल हृदय 2 शरीर क्रिया विज्ञान के अध्ययन के लिए एक प्रमुख उपकरण है. कार्डियक arrhythmias, विशेष रूप से उन है कि की transmembrane 20 संभावित प्रतिदीप्ति इमेजिंग का उपयोग अध्ययन में विशेष रूप से उपयोगी है. एक लाभ यह है कि पृथक दिल के पूरे epicardium 21, 22 देखा जा सकता है. एक और लाभ यह है कि, रक्त के लिए इसके विपरीत में, एक स्पष्ट बिल्लौर की तरह बफर समाधान के साथ छिड़काव प्रतिदीप्ति संकेत के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है. एक सीमा है कि हृदय चयापचय, जो अक्सर दिल शारीरिक प्रीलोड और afterload दबाव के के संदर्भ के भीतर काम पूरा करने की आवश्यकता के अध्ययन के लिए Langendorff तकनीक नहीं अच्छी तरह से अनुकूल है.

चयापचय अध्ययन, नीली Langendorff तकनीक के लिए संशोधन पेश करने के लिए उपयुक्त बाएं निलय (LV) प्रीलोड और afterload के 3 दबाव की स्थापना के लिए पृथक हृदय की तैयारी की प्रासंगिकता तरक्की.मॉडल अलग एल.वी. काम दिल मॉडल के रूप में जाना जाता है और बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है के एल.वी. प्रदर्शन और 4-6 चयापचय अध्ययन. एल.वी. काम दिल मॉडल कार्यात्मक मूल्यांकन Langendorff मॉडल के लिए करने के लिए बेहतर है, अभी तक यह एक अच्छी तरह से भरा हुआ सही वेंट्रिकल (आर वी) प्रदान नहीं करता है. Demmy एट अल. एल.वी. काम दिल मॉडल 7, 8 के एक संशोधन के रूप में पहली बार एक बाइवेन्ट्रिकुलर मॉडल (एल.वी. और आर.वी.) की सूचना दी. उन्होंने पाया कि स्ट्रोक मात्रा, कार्डियक आउटपुट, और दबाव काम कर एल.वी. मोड से बाइवेन्ट्रिकुलर काम कर रहे आठ मोड परिवर्तित दिलों में सुधार विकास. एक अच्छी तरह से भरा हुआ आर.वी. भी पट भर असामान्य दबाव gradients ह्रासमान द्वारा वंशीय समारोह में सुधार है. बाइवेन्ट्रिकुलर काम कर दिल को 3 8 घंटे के लिए महाधमनी उत्पादन, फेफड़े प्रवाह, महाधमनी दबाव मतलब है, फेफड़े रक्तचाप, हृदय गति और myocardial एटीपी मतलब है, और creatine फॉस्फेट के स्तर को बनाए रखने के लिए दिखाया गया है. बाइवेन्ट्रिकुलर काम कर दिल अध्ययन आमतौर पर दिल fr उपयोगओम चूहों और खरगोशों के रूप में छोटे जानवर, क्योंकि कार्डियक आउटपुट और perfusate की आवश्यक मात्रा बड़े जानवरों के दिल के लिए तुलना में बहुत कम हैं. हालांकि, बाइवेन्ट्रिकुलर काम दिल अध्ययन सूअर, कुत्तों, और यहाँ तक कि इंसानों 23, 24 से दिलों का उपयोग आयोजित किया गया है.

बाइवेन्ट्रिकुलर कार्य मोड में अलग दिल की चयापचय की मांग काफी Langendorff छिड़काव की तुलना में अधिक है. यह महत्वपूर्ण है कि perfusate समाधान पर्याप्त ऑक्सीजन और चयापचय सब्सट्रेट लिए बाइवेन्ट्रिकुलर दिल समारोह का समर्थन प्रदान करते हैं. क्रेब्स – Henseleit 16, 17, 25 या 26 Tyrodes, 27 के रूप में मानक बिल्लौर की तरह बफर समाधान, के रूप में उच्च के रूप में ऑक्सीजन solubilities 5.6 मिलीग्राम / एल. जब इन समाधान carbogen (95% 2 हे और 5% सीओ 2 के एक गैस मिश्रण) के साथ मार डाला जाता है और चयापचय उपयुक्त सब्सट्रेट (ग्लूकोज, dextrose, और / या सोडियम पाइरूवेट) होते हैं, वे बाइवेन्ट्रिकुलर काम कर आदर्श पर दिलों की धड़कन के लिए उपयुक्त हैंअल साइनस दर (लगभग 180 एक खरगोश के लिए bpm).

तेजी से लय के लिए मेटाबोलिक मांग बढ़ जाती है और हैं मानक perfusates में भंग ऑक्सीजन की मात्रा पर्याप्त नहीं हो सकता है पूरी तरह से एक बाइवेन्ट्रिकुलर काम कर दिल है कि उच्च दर पर करार का समर्थन हो सकता है. बिल्लौर की तरह बफर एरिथ्रोसाइट्स या पूरे रक्त के साथ मिश्रित युक्त समाधान काम कर दिल की तैयारी में इस्तेमाल किया गया है करने के लिए पर्याप्त ऑक्सीजन की उपलब्धता सुनिश्चित करने के लिए. पिछले अध्ययनों से पता चला है कि एक समाधान क्रेब्स – Henseleit एरिथ्रोसाइट्स जोड़ने कठोर पेसिंग प्रोटोकॉल के दौरान काम कर दिल समारोह में सुधार और भी दिया ventricular fibrillation के 16 घटनाओं को कम. एरिथ्रोसाइट्स या पूरे रक्त का मिश्रण का उपयोग की एक सीमा है कि कि हीमोग्लोबिन प्रकाश तरंग दैर्ध्य है कि प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए 13 उपयोग किया जाता है के साथ हस्तक्षेप है. Albumin जैसे अन्य substrates, भी के समाधान perfusate दिल व्यवहार्यता लम्बा और 28 के edema कम करने के लिए जोड़ा जा सकता है.

प्रतिदीप्ति इमेजिंग के दौरान उत्तेजना प्रकाश की तीव्रता अधिक हो सकता है और प्रकाश वितरण एक समान होना चाहिए चाहिए. वर्दी रोशनी हासिल हमेशा epicardial सतह की वक्रता की वजह से आसान नहीं है. हमारे अध्ययन में, हम छवि fNADH पारा दीपक से प्रकाश (350 ± 25 एनएम) फ़िल्टरिंग. एक बंटवारा फाइबर ऑप्टिक प्रकाश गाइड epicardial सतह पर यूवी प्रकाश प्रत्यक्ष करने के लिए प्रयोग किया जाता है. वर्दी प्रकाश उपयुक्त स्थिति दो उत्पादन ferrules द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. यूवी एलईडी प्रकाश स्रोतों को भी इस्तेमाल किया जा सकता है के रूप में हम 3 चित्र में दिखा दिया है. एलईडी स्रोतों अपेक्षाकृत सस्ती कर रहे हैं तो कई स्रोतों एक इमेजिंग सिस्टम में शामिल किया जा सकता है. एल ई डी भी उच्च दरों पर पर और बंद कर सकते हैं साइकिल छवि अधिग्रहण के साथ उत्तेजना प्रकाश सिंक्रनाइज़.

NADH की Photobleaching ऊतक रोशनी के समय को कम करने से 29 कम से कम किया जाना चाहिए. इस पर रोशनी साइकिल द्वारा और एक इलेक्ट्रॉन का उपयोग बंद किया जा सकता हैआईसी शटर और एक चिराग या एक एलईडी प्रकाश व्यवस्था और एक नियंत्रक के साथ. अगर रोशनी हृदय चक्र के साथ सिंक्रनाइज़ है, तो fNADH छवि अधिग्रहण पाद लंबा करने के लिए सीमित किया जा सकता है, जो प्रतिदीप्ति संकेतों में गति विरूपण साक्ष्य को कम करेगा. Trigging रोशनी और छवि अधिग्रहण एल.वी. दबाव के रूप में एक दबाव संकेत, का उपयोग करते हुए, एक तरीका यह करना होगा.

हम अपने अध्ययन में देखा है कि fNADH में प्रति इकाई समय के परिवर्तन से अधिक 400 bpm में अधिक से 200 bpm में 5X हो सकता है. यह इंगित करता है कि तेजी से लय दिल की redox राज्य तरक्की. चाहे या नहीं इस hypoxia या NAD NADH oxidize के myocytes की अक्षमता के कारण होता है जल्दी से NADH के संचय से बचने के लिए पर्याप्त + अभी भी एक अनुत्तरित प्रश्न है.

एक बाइवेन्ट्रिकुलर काम कर दिल की तैयारी के प्रदर्शन कई कारकों पर प्रासंगिक है. सबसे महत्वपूर्ण में से एक उचित प्रीलोड और afterload दबाव के सेट करने के लिए शारीरिक नकलस्थिति है कि जांच के अधीन हैं. विशेष रूप से, एल.वी. afterload (महाधमनी दबाव) के प्रणालीगत दबाव का प्रतिनिधित्व करने के लिए समायोजित किया जाना चाहिए. अगर यह बहुत अधिक है, एल.वी. दबाव से उबरने, प्रत्यावहन में जिसके परिणामस्वरूप में सक्षम नहीं होगा. दबाव है कि बहुत कम है पर प्रतिकूल कोरोनरी छिड़काव प्रभावित करेगा. एल.वी. प्रीलोड दबाव (बाएं आलिंद दबाव) भी एक अंत डायस्टोलिक मात्रा है कि प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल के लिए उपयुक्त है प्रदान करने के लिए समायोजित किया जाना चाहिए.

ऊतक रहने fNADH इमेजिंग प्रतिदीप्ति इमेजिंग के 13 की स्थापना की एक विधा है. हृदय ऊतक के लिए आवेदन बारलो और संभावना द्वारा सचित्र किया गया था जब वे क्षेत्रीय इस्कीमिक ऊतकों के भीतर fNADH के हड़ताली एक कोरोनरी पोत 14 की ligation के बाद उन्नयन की सूचना दी. उनके fNADH छवियों में फेयरचाइल्ड आस्टसीलस्कप कैमरा और यूवी फ़्लैश फोटोग्राफी का उपयोग कर फिल्म पर दर्ज किया गया. Coremans एट अल. इस measur के लिए NADH reflectance / प्रतिदीप्ति यूवी अनुपात का उपयोग अवधारणा पर विस्तारई Langendorff रक्त perfused चूहा 30 दिल की epicardium की चयापचय राज्य. एक videofluorimeter इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया गया था और एक वीडियो रिकॉर्डर का उपयोग कर डेटा दर्ज की गई थी. बाद में, Scholz एट अल. एक spectrograph और photodiode के एल.वी. के एक बड़े क्षेत्र से औसत fNADH को मापने के सरणी इस्तेमाल किया. इस दृष्टिकोण epicardial प्रतिदीप्ति विषमताओं और संचलन में स्थानीय रूपांतरों के प्रभाव को कम करते हुए 31 fNADH की macroscopic काम से संबंधित बदलाव खुलासा. इस दृष्टिकोण एक fNADH इमेजिंग डाटासेट, के रूप में चित्रा 2 में सचित्र के सभी तख्ते भर में ब्याज की एक क्षेत्र के लिए औसत fNADH स्तर कंप्यूटिंग के लिए समान है. जैसा कि हम इस लेख में प्रस्तुत किया है, आज की तकनीक उच्च गति सीसीडी कैमरों प्रदान करता है और डिजिटल उच्च शक्ति spotlights यूवी नियंत्रित. इन प्रौद्योगिकियों fNADH और हृदय चयापचय की गतिशीलता spatiotemporal कई नए दृष्टिकोण से अध्ययन करने के लिए सक्षम करें. प्रकाशिकी और प्रकाश स्रोत की अपेक्षाकृत कम लागत च बनाता हैNADH पारंपरिक हृदय ऑप्टिकल मैपिंग सिस्टम के लिए एक उपयोगी सहायक इमेजिंग 9, 32

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

इस काम एनआईएच (मेगावाट Kay R01-HL095828) के से एक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Chemical Company Catalogue Number
NaCl Sigma-Aldrich, St. Louis, MO S-3014
KCl Sigma-Aldrich, St. Louis, MO P3911-500G
CaCl2 Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ C77-500
MgSO4 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO M-7506
NaHCO3 Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ S-233
KH2PO4 Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ 423-316
Glucose Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 158968-500G
NaPyruvate Sigma-Aldrich, St. Louis, MO P2256-25G
Albumin Sigma-Aldrich, St. Louis, MO A9418-100G
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Asfour, H., Wengrowski, A. M., Jaimes III, R., Swift, L. M., Kay, M. W. NADH Fluorescence Imaging of Isolated Biventricular Working Rabbit Hearts. J. Vis. Exp. (65), e4115, doi:10.3791/4115 (2012).
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