A الفحص الإنقاذ والتحول لفحص مضاد الليشمانيات الطفيلي داخل الخلايا ضد<em> الليشمانيا الدونوفانية</em> Amastigotes في THP1 الحادة اللوكيميا الإنسان الوحيدات الخط الخليوي
Summary
A فحص الطفيليات الإنقاذ وتحول الخلايا المصابة مع THP1<em> في المختبر</em> مع<em> الليشمانيا الدونوفانية</em> تم الأمثل لفحص المخدرات المضادة لليشماني. ويشمل الفحص تمايز الخلايا THP1، والعدوى مع promastigotes والعلاج بالأدوية الاختبار، تحلل للرقابة من الضامة المصابة، إنقاذ amastigotes، والتحول إلى promastigotes رصد النمو والانتشار المشيقة مع مقايسة فلوروميتريك.
Abstract
Leishmaniasis is one of the world’s most neglected diseases, largely affecting the poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million people are considered at risk of contracting leishmaniasis, and approximately 2 million new cases occur yearly1. Leishmania donovani is the causative agent for visceral leishmaniasis (VL), the most fatal form of the disease. The choice of drugs available to treat leishmaniasis is limited 2;current treatments provide limited efficacy and many are toxic at therapeutic doses. In addition, most of the first line treatment drugs have already lost their utility due to increasing multiple drug resistance 3. The current pipeline of anti-leishmanial drugs is also severely depleted. Sustained efforts are needed to enrich a new anti-leishmanial drug discovery pipeline, and this endeavor relies on the availability of suitable in vitro screening models.
In vitro promastigotes 4 and axenic amastigotes assays5 are primarily used for anti-leishmanial drug screening however, may not be appropriate due to significant cellular, physiological, biochemical and molecular differences in comparison to intracellular amastigotes. Assays with macrophage-amastigotes models are considered closest to the pathophysiological conditions of leishmaniasis, and are therefore the most appropriate for in vitro screening. Differentiated, non-dividing human acute monocytic leukemia cells (THP1) (make an attractive) alternative to isolated primary macrophages and can be used for assaying anti-leishmanial activity of different compounds against intracellular amastigotes.
Here, we present a parasite-rescue and transformation assay with differentiated THP1 cells infected in vitro with Leishmania donovani for screening pure compounds and natural products extracts and determining the efficacy against the intracellular Leishmania amastigotes. The assay involves the following steps: (1) differentiation of THP1 cells to non-dividing macrophages, (2) infection of macrophages with L. donovani metacyclic promastigotes, (3) treatment of infected cells with test drugs, (4) controlled lysis of infected macrophages, (5) release/rescue of amastigotes and (6) transformation of live amastigotes to promastigotes. The assay was optimized using detergent treatment for controlled lysis of Leishmania-infected THP1 cells to achieve almost complete rescue of viable intracellular amastigotes with minimal effect on their ability to transform to promastigotes. Different macrophage:promastigotes ratios were tested to achieve maximum infection. Quantification of the infection was performed through transformation of live, rescued Leishmania amastigotes to promastigotes and evaluation of their growth by an alamarBlue fluorometric assay in 96-well microplates. This assay is comparable to the currently-used microscopic, transgenic reporter gene and digital-image analysis assays. This assay is robust and measures only the live intracellular amastigotes compared to reporter gene and image analysis assays, which may not differentiate between live and dead amastigotes. Also, the assay has been validated with a current panel of anti-leishmanial drugs and has been successfully applied to large-scale screening of pure compounds and a library of natural products fractions (Tekwani et al. unpublished).
Protocol
Representative Results
Discussion
هناك العديد من الطرق المتاحة لفحص المخدرات المضادة لليشماني يعتمد على البلاعم، ليشمانة النماذج. ويمكن أن يتم المقايسات مع الضامة التي تم جمعها من الحيوانات المضيفة الخلايا الافرازات البريتوني وهي (PEC)، وخلايا الدم الطرفية الوحيدات (PBMC) 6 أو نخاع العظام المستمدة الضامة (BMM) أو في خطوط الخلايا الوحيدات مثل الماوس (J774 وRAW264.7 ) 7 والبشرية (THP1، U937، HL-60) 8 خلايا الوحيدات. يجب أن المقايسات، والتي تستخدم تقسيم الخلايا المضيفة، وضمان أن يتم النظر في الآثار التباس النشاط المخدرات على كل من الطفيليات والخلايا المضيفة عدد. الضامة متباينة الأولية التي تم جمعها من مصادر مختلفة مثل الفئران والجرذان هي غير الفاصل في الطبيعة، ولكن هذه الاستعدادات قد لا يكون خلية خلية متجانسة السكان. خطوط الخلايا خلايا الوحيدات المستمدة متجانسة في طبيعتها، والتي تعتبر أفضل نموذج للفحص ليشمانة البلاعم-مقرا لها. من مختلف خطوط الخلايا الوحيدات، diffeيمكن rentiated THP1 الخلايا (خلايا سرطان الدم الحاد الإنسان الوحيدات الخط) تشكيل أحادي الطبقة غير تقسيم ويقدم بديلا جذابا لالضامة معزولة الأولية.
ويمكن أن يتم فحص البلاعم ليشمانة-القائم في عدة طرق. التقييم المجهري الكلاسيكية يعتمد على خلية الطفيل العد المباشر و9 هو كثيفة العمالة. غياب الأتمتة يحد من فائدة هذا الفحص. عد الخلايا تستغرق وقتا طويلا، وربما إعطاء تقرير غير دقيق عن القيم 50 IC منذ تحديد الجدوى الطفيلي من خلال إجراء تلطيخ أمر صعب. يمكن استخدام العديد من الأصباغ الفلورية والاجسام المضادة للفحوصات تدفق cytometric 10 و 11، لكنها محدودة أيضا هذه المقايسات بسبب حساسية أقل والحد من الفترة الزمنية للعلاج المخدرات ليوم واحد فقط. هناك عدة فحوصات الجينات مراسل المتاحة لقياس نمو الخلايا amastigotes 12،13،14. والآليقد يكون من الممكن فحص إد باستخدام الجينات مراسل، ولكن هذه المقايسات أيضا بعض العوائق. أولا، معظم هذه المقايسات تتطلب انتقاء الأدوية للحفاظ على التعبير episomal من الجينات مراسل، والتي قد لا تكون مثالية لتجربة المخدرات الفرز. يمكن أن الطريقة التي يتم من خلالها عرض الجينات مراسل تؤثر أيضا على خصائص الفسيولوجية للطفيل ويكون لها تأثير على الفحص. إذا كان الجين هو مراسل جزء من البلازميد episomal، قد خرج النسبية لمراسل تعتمد على عدد نسخة من البلازميد بالنقل (والذي يختلف من خلية إلى أخرى) بدلا من التركيز على نشاط المخدرات 14. بعض الطفيليات التي تتحول مراسل الطفيليات لا تحتاج الضغط الانتقائي للحفاظ على الجينات مراسل، ولكن يمكن أن يكون هناك العواقب البيولوجية إما عن طريق تعطيل البنية الجينية أو فقط من خلال وجود البروتينات مراسل الأجنبية 15. في بعض المقايسات الجينات مراسل القائمة، وهناكالقضايا حساسية النشاط والخلفية 16. الأهم من ذلك، فإن العديد من المقايسات مراسل التعبير الجيني، وخاصة مع مراسل واحد GFP gene15، لا يفرق بين الخلايا وamastigotes الحية والميتة. قد يعتمد على الجينات المقايسات مراسل وسيفيراز التمييز بين الخلايا الحية والميتة amastigotes، ولكن الركيزة وتحلل الخلية العازلة لهذه القياسات ليست مكلفة على نطاق واسع الفحص 17. للتغلب على هذه العيوب والقيود المفروضة على فحوصات الفرز السابقة، البلاعم ليشمانة القائم، وقد وضعنا هذا الاختبار الأمثل والطفيليات الإنقاذ والتحول. ويستند هذا الفحص على THP1 الخلايا، التي لديها تجانس جيدة وغير قابلة للتقسيم في الطبيعة، والخلايا المضيفة.
الفحص الطفيلي الإنقاذ فإن التحول-الفحص الموصوفة هنا هو مقارنة لفحص يعتمد على الصورة الرقمية لتحليل العد المباشر للamastigotes داخل الخلايا. الفلورسنت وDIC المجهر، ايماج الرقميةوقد المكرر ه من التحليلات ليماغيج الفرق العد والفرز لنواة ونواة البلاعم الطفيلي مزيد من الفحص المجهري العد. التقاط الصور تحت ضوء الفلورسنت الفلاتر والفرق المقابل تدخل (DIC) مرشحات تحسنت جودة الصورة الرقمية للفرز أكثر دقة من الطفيليات داخل الخلايا. يمكن دمجها كل الصور الفلورسنت ومدينة دبي للإنترنت للحصول على الصور الرقمية مع الخطوط العريضة واضحة خلية البلاعم والخلايا نوى الفلورسنت. يمكن نواة البلاعم ونواة الطفيلي يعترف تفاضلي مع يماغيج. لذلك، على حد سواء الرقمية صورة التحليل المباشر العد والفحص الطفيلي الإنقاذ فإن التحول الفحص، لديها القدرة اللازمة لأتمتة والتطبيق على نطاق واسع الفرز. الخطوات الحاسمة في الطفيل الإنقاذ، فإن التحول الفحص هي: (أ) الغسيل المتكرر لمزارع الخلايا بعد التعرض لTHP1 promastigotes الليشمانيا، لضمان إزالة كاملة تقريبا من غير متدربalized promastigotes و (ب) تحلل الخلايا تسيطر THP1 المصابة مع SDS. ويجوز لكل من الخطوات أيضا يمكن السيطرة عليها مع الأتمتة ويجب أن لا حل وسط مع الإنتاجية للمقايسة. الخطوة الثانية من الغسيل، بعد التعرض للإصابة خلايا الليشمانيا THP1 للعقاقير اختبار / مركبات يزيل ما تبقى من غير المنضوية الطفيليات، إن وجدت. الطفيلي الإنقاذ فإن التحول-الفحص يوفر مزايا هامة على القائمة المجهرية جينات مراسل، والمقايسات تحليل الصور. الفحص بسيط وقوية، وقابلة للتكرار، ويمكن أن يكون آليا لفحص واسعة النطاق، وبالتالي ينبغي أن يكون التطبيق هاما في فحص المركبات مكتبات كبيرة لاكتشاف جديد للأدوية المضادة لليشماني. مزيد، ويمكن أيضا أن تطبق الفحص لتقييم العدوى السريرية، وكذلك، العزلات مختبر الليشمانيا في المختبر.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الاتفاق العلمية نسنبر-USDA-ARS رقم 58-6408-2-0009؛ CDMRP منحة جائزة # W81XWH-09-2-0093 عن طريق البحث الطبي التابع للجيش الأميركي وقيادة العتاد.
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA) | Sigma-Aldrich USA | P1585 | Required for differentiation of THP1 cells. |
| RPMI-1640 Medium | Invitrogen | 23400021 | |
| Lab-TeK Chamber Slide System (16 Chamber) | Thermo Scientific Nunc | 178599 | |
| Clear, Flat-Bottom, 96-Well Plates | BD Falcon | 353075 | Plates to perform 96-well plate assay |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich USA | A4888 | Standard anti-leishmanial drug dissolve in DMSO (2 mg/ml) |
| Pentamidine Isothionate Salt | Sigma-Aldrich USA | P 0547 | Standard anti-leishmanial drug dissolve in DMSO (2 mg/ml) |
| Miltefosine | EMD Biosciences USA | 475841 | Standard anti-leishmanial drug dissolve in serum-free RPMI-1640 medium (prepare fresh) (2 mg/ml) |
| Sodium Stibogluconate | EMD Biosciences USA | 567565 | Standard anti-leishmanial drug prepare in RPMI-1640 with 4% FBS. (1 mg/ml) |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich USA | L 5750 | |
| Fluorescence Microscope | NIKON | ECLIPSE 90i | |
| Fluorescence Microplate Reader | BMG | Polar Star Galaxy | |
| Mounting Medium | Sigma-Aldrich USA | M 1289 | |
| alamarBlue | AbD Serotec | BUF012 B | |
| SYBR Green I | Sigma-Aldrich USA | S 9430 | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Sci. | 523500 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma-Aldrich USA | P2256 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich USA | M6250 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11050H | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich USA | P9416 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich USA | P6474 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich USA | T8787 | |
| NP-40 | Calbiochem | 492016 |
Referencias
- WHO. . Control of the leishmaniasis: report of a meeting of the WHO Expert Committee on the Control of Leishmaniasis. Xii, 22-26 (2010).
- Croft, S. L., Seifert, K., Yardley, V. Current scenario of drug development for leishmaniasis. Indian J. Med. Res. 123 (3), 399-410 (2006).
- Croft, S. L., Sundar, S., Fairlamb, A. H. Drug Resistance in Leishmaniasis. Clinical Microbiology reviews. 19 (1), 111-126 (2006).
- Mikus, J., Steverding, D. A simple colorimetric method to screen drug cytotoxicity against Leishmania using the dye AlamarBlue. Parasitology International. 48 (3), 265-269 (2000).
- Callahan, H. L., Portal, A. C., Devereaux, R., Grogl, M. An Axenic Amastigote System for Drug Screening. Antimicrob. Agents Chemother. 41 (4), 818-822 (1997).
- Seifert, K., Escobar, P., Croft, S. L. In vitro activity of anti-leishmanial drugs against Leishmania donovani is host cell dependent. J. Antimicrob. Chemother. 65 (3), 508-511 (2010).
- Kolodziej, H., Kiderlen, A. F. Antileishmanial activity and immune modulatory effects of tannins and related compounds on Leishmania parasitized RAW 264.7 cells. Phytochemistry. 66 (17), 2056-2071 (2005).
- Maia, C., et al. Infectivity of five different types of macrophages by Leishmania infantum. Acta Tropica. 103 (2), 150-155 (2007).
- Neal, R. A., Croft, S. L. An in vitro system for determining the activity of compounds against the intracellular amastigote form of Leishmania donovani. J. Antimicrob. Chemother. 14, 463-475 (1984).
- Abdullah, S. M., Flath, B., Presber, H. W. Comparison of different staining procedures for the flow cytometric analysis of U-937 cells infected with different Leishmania-species. J. Microbiol Methods. 37 (2), 123-138 (1999).
- Giorgio, C. D., et al. Flow Cytometric Detection of Leishmania Parasites in Human Monocyte-Derived Macrophages: Application to Antileishmanial-Drug Testing. Antimicrob Agents Chemother. 44 (11), 3074-3078 (2000).
- Mandal, S., et al. High throughput screening of Leishmania donovani clinical isolates against drug using a colorimetric β Lactamase assay. Indian J. Exp. Biol. 47 (6), 475-479 (2009).
- Chan, M. M. Y., Bulinski, J. C., Chang, K. P., Fong, D. A. Microplate assay for Leishmania amazonensis promastigotes expressing multimeric green fluorescent protein. Parasitol. Res. 89 (4), 266-271 (2003).
- Buckner, F. S., Wilson, A. J. Colorimetric assay for screening compounds against Leishmania Amastigote Grown in macrophages. Am. J. Trop. Med. 72 (5), 600-605 (2005).
- Sereno, D., et al. Advances and perspectives in Leishmania cell based drug-screening procedures. Parasitol. Int. 56 (1), 3-7 (2007).
- Gupta, S., Nishi, Visceral leishmaniasis: experimental models for drug discovery. Indian J. Med. Res. 133, 27-39 (2011).
- Roy, G., et al. Episomal and stable expression of the luciferase reporter gene for quantifying Leishmania spp. Infections in macrophages and in animal models. Mol. Biochem. Parasitol. 110 (2), 195-206 (2000).
