वायरल शाही सेना के प्रतिदीप्ति द्वारा जांच<em> बगल में</em> संकरण (मछली)
Summary
एक प्रतिदीप्ति<em> बगल में</em> संकरण (मछली) विधि नेत्रहीन वायरल जीनोमिक शाही सेना का पता लगाने प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने के लिए विकसित किया गया था. जांच वायरल शाही सेना है कि तब संकरण और immunofluorescence तकनीक के का एक संयोजन का उपयोग कर पहचाना जा सकता है विशिष्टता के साथ किया जाता है. इस तकनीक को स्थिर राज्य में वायरल शाही सेना या डीएनए के स्थानीयकरण की पहचान का लाभ प्रदान करता है, intracellular वायरस तस्करी की घटनाओं के नियंत्रण पर जानकारी प्रदान करते हैं.
Abstract
Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8.
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.
Protocol
Discussion
/ मछली यदि सह विश्लेषण वायरल शाही सेना कोशिकाओं है जो अब 9,15,16 परिष्कृत किया गया है में कल्पना के लिए एक विश्वसनीय तरीका है. कई वर्षों के दौरान, हम शाही सेना के लिए धुंधला हो जाना का एक परिष्कृत विधि विकसित किया है. इस तकनीक को सेल प्रकार की एक विस्तृत सरणी प्रदान की जांच लक्ष्य 17 शाही सेना के लिए विशिष्ट है पर इस्तेमाल किया जा सकता है. डीआईजी के साथ जांच लेबल के द्वारा, हम सरल धुंधला द्वारा शाही सेना visualizing की सक्षम हैं. जब शाही सेना और अन्य प्रोटीन के लिए धुंधला संयुक्त कर रहे हैं, मछली / यदि सह विश्लेषण सेलुलर संरचनाओं और प्रोटीन / शाही सेना स्थानीयकरण का पालन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण बन गया है.
आरएनए का पता लगाने की विशिष्टता काफी अधिक है. यह चित्रा 2 में सचित्र है. मूल काम है कि वायरल जीनोमिक शाही सेना स्थानीयकरण, मछली की स्थापना की है कि रेव की कमी 18 नाभिक में वायरल शाही सेना फंस पर ध्यान केंद्रित के कुछ में. इस के बाद से, प्रचुर मात्रा में वायरल जीनोमिक आरएनए स्थानीयकरण पर नई जानकारी तकनीकों का उपयोग कर प्राप्त किया गया हैई यहाँ उल्लिखित. Overexpressing सेलुलर प्रोटीन के द्वारा, विशिष्ट नहीं है और वायरल शाही सेना की आबादी सेल के विभिन्न क्षेत्रों में स्थानीयकरण मजबूर किया जा सकता है. Overexpression RILP, जो phenotype जैसा दिखता है प्राप्त जब hnRNP A2 में siRNA को समाप्त हो गया है एचआईवी -1 व्यक्त कोशिकाओं 13, शाही सेना दिख MTOC में जमा करने के लिए कारण बनता है. सेलुलर परिधि p50/Dynamitin या dynein डोमेन से intracellular वायरल जीनोमिक शाही सेना की विज्ञप्ति में भारी श्रृंखला 1 परिणाम की overexpression पछाड़ना (वायरल जीनोमिक शाही सेना ऋण अंत मोटर प्रोटीन, dynein अक्षम सेल परिधि के लिए धक्का दिया जा सकता है चित्रा 2). RILP, RILPΔN, एक उत्परिवर्ती जो अब dynein मोटर बांध, disperses (द्वारा टैग LAMP1) के cytoplasm में endosomes क्योंकि वे अब सक्रिय रूप से juxtanuclear डोमेन में स्थानीयकृत हैं. इन परिणामों एचआईवी -1 जीनोमिक शाही सेना और विशेष रूप से एक प्लास्टिक की जनसंख्या की धारणा को इंगित करें, कि एचआईवी -1 जीनोमिक अलग पूलवायरल प्रतिकृति चक्र में कभी कभी पहचान योग्य भूमिकाओं के साथ मौजूद शाही सेना. ये वही विचार पहले से ही इस mRNA, 19 चुप द्वारा इनकोडिंग प्रोटीन के लिए पहचान की गई है.
/ मछली यदि सह – विश्लेषण कि एंटीबॉडी पसंद और उपलब्धता से जुड़े हुए हैं का उपयोग करता है के लिए सीमाएं हैं. प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी, और उनके सांद्रता का सबसे अच्छा संयोजन के अनुकूलन के लिए समय लेने के लिए अनुकूलन (टेबल 1 और 2 देखें). Hybridomas से बना या प्रमुख कंपनियों द्वारा उत्पादित एंटीबॉडी सांद्रता जो 1:02 से 1:2000 तक कहीं भी भिन्न है, लेकिन सर्वोत्तम परिणामों के लिए निर्माता द्वारा प्रदान की दिशा निर्देशों का पालन सुनिश्चित हो सकता है. मेजबान में जो एंटीबॉडी का उत्पादन किया है भी विचाराधीन लिया जाना चाहिए. बकरी एंटीबॉडी के साथ मिलाकर देखना भेड़ भी उच्च पृष्ठभूमि में इस संयोजन के परिणाम पार प्रजातियों मान्यता (नहीं दिखाया डेटा) के कारण के रूप में प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी में से परहेज किया जाना चाहिए. एलेक्सा-Fluor seconda के लिएry के एंटीबॉडी, एकाग्रता सेट में लगभग किसी भी एंटीबॉडी के लिए 1:500 पर इस्तेमाल किया जा सकता है. / मछली यदि सह विश्लेषण के लिए अन्य दोष के रूप में इस रिपोर्ट में वर्णित है यह स्थिर राज्य में इसके स्थान पर शाही सेना का कब्जा है, के बाद कोशिकाओं को निर्धारित किया गया है और paraformaldehyde और डिटर्जेंट (चित्रा 1) का उपयोग permeabilized.
हालांकि, जीवित कोशिकाओं में शाही सेना इमेजिंग 20-22 का मतलब है की एक किस्म के माध्यम से हासिल किया है, ज्यादातर वायरल शाही सेना जीनोम कि GFP जैसे फ्लोरोसेंट प्रोटीन से टैग कर रहे हैं के रूपांतरों का उपयोग कर. हालांकि, अतिरिक्त जीवित कोशिकाओं में शाही सेना स्थानीयकरण की पहचान का मतलब करने के लिए सतह के लिए जारी है. इन नए तरीकों के 23 पालक, 24 तस्वीर के माध्यम या MTRIP 2 द्वारा टैगिंग शाही सेना शामिल है. इन तकनीकों में भी आवश्यकता सहित कुछ कमियां से ग्रस्त करने के लिए substrates के जोड़ने या कि एक आधा भाग mRNA के टैग के क्रम में माइक्रोस्कोपी द्वारा mRNA का पता लगाने के इंजीनियर किया जाना चाहिए पहले कोशिकाओं permeabilize के. वास्तव में, प्रमुख उन्नत स्तरइस रिपोर्ट में उल्लिखित मछली विश्लेषण की ntage तथ्य यह है कि देशी शाही सेना अनछुए है सबसे physiologically प्रासंगिक परिणाम के लिए अग्रणी में निहित है.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक धन्यवाद पद्धति के विकास में योगदान के लिए प्रयोगशाला के अतीत और वर्तमान सदस्यों को सलाह के लिए यहाँ और एलन Cochrane उल्लिखित. ला स्वास्थ्य (CIHR) डॉक्टरल फैलोशिप अनुसंधान और AJM संस्थान कनाडा के एक प्राप्तकर्ता है फ्रेजर Monat, और MacPherson कैरियर पुरस्कार द्वारा समर्थित है. इस काम CIHR (अनुदान # एमओपी 56,974) से एक अनुदान द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 18mm coverslips | VWR | 48380 046 | |
| 16% paraformaldehyde | J.T. Baker | S898-07 | To make 4%: Dissolve 20g in 500mL 1XDPBS at 60°C with 5 drops NaOH. pH to 7.2 off the heat and store at -20 °C. Do not exceed 70°C! |
| Triton-X | OmniPur | 9400 | |
| Micro Elute Gel Extraction Kit | Roche | D6294-02 | |
| DIG RNA Labelling Mix | Roche | 11277073910 | |
| Transcription T7 RNA Polymerase | Invitrogen | 18033-019 | |
| Quick Spin Columns | Roche | 11814427001 | |
| DNase I | Invitrogen | 18047-019 | |
| 1X DPBS | Gibco | 14190-250 | |
| Formamide | EMD | FX0420-8 | |
| tRNA | Invitrogen | 15401-021 | |
| RNase OUT | Invitrogen | 10777-019 | |
| Fluorescent Antibody Enhancer Set for DIG Detection #4 (blocking solution) | Roche | 1768506 | |
| Alexa Fluor secondary antibodies | Invitrogen | See Table 2 | |
| Hybridization Oven | Boekel Scientific | Model 24100 | |
| Microslides | VWR | 48300-047 | |
| Immunomount | Thermoscientific | 9990402 |
Table 1. Identification of specific reagents and equipment
| Species of anti-DIG antibody (dilution; company, catalogue number) | Colours | Alexa Fluor used (1:500) |
| Mouse (1:500;Sigma, B7405) | green | Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse (Invitrogen, A21202) |
| red | Alexa Fluor 594 donkey anti-mouse (Invitrogen, A21203) | |
| blue | Alexa Fluor 647 donkey anti-mouse (Invitrogen, A31571) | |
| Sheep (1:200;Roche, 11376623) | green | Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep (Invitrogen, A11015) |
| red | Alexa Fluor 594 donkey anti-sheep (Invitrogen, A11016) | |
| blue | Alexa Fluor 647 donkey anti-sheep (Invitrogen, A21448) |
Table 2. Combinations of secondary antibodies and anti-DIG listed with catalogue numbers and concentrations.
Referencias
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