הקרינה<em> באתרו</em> (דגים) שיטת ההכלאה פותח כדי לזהות ויזואלית RNA הגנומי ויראלי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. בדיקה הוא עשה עם סגוליות על RNA ויראלי ניתן לזהות באמצעות שילוב של הכלאה וטכניקות immunofluorescence. טכניקה זו מציעה את היתרון של זיהוי לוקליזציה של רנ"א נגיפי או דנ"א על המצב היציב, מתן מידע על שליטה של אירועים הסחר תאיים וירוס.
וירוסים להדביק תאים לעורר שינויים ספציפיים פונקציות תאים רגילים המשמשים להסיט את האנרגיה והמשאבים לצורך שכפול נגיפי. היבטים רבים של תפקוד התא המארח הם השתלטו על ידי וירוסים, בדרך כלל על ידי ביטוי של מוצרים גנים ויראלי סלולריים לגייס המארחות חלבונים מנגנונים. יתר על כן, וירוסים ספציפיים מהנדס האברונים קרום או תג על מנת שלפוחית ניידים וחלבונים רכב למקד אזורים של התא (בזמן זיהום דה נובו, וירוסים משתלטים חלבונים רכב מולקולריים כדי למקד את הגרעין, לאחר מכן, במהלך הרכבת הנגיף, הם יוכלו לחטוף את הסלולרי מנגנונים שיסייעו באסיפה של וירוסים). פחות מובן כיצד וירוסים, במיוחד אלו עם הגנום RNA, לתאם את הסחר תאיים של חלבונים ושל רכיבים רנ"א וכיצד להשיג הרכבה של חלקיקים זיהומיות בבית לוקוסים ספציפיים בתא. המחקר של לוקליזציה RNA החלה במחקר מוקדם. לפתח אותם האיקריוטים נמוכותbryos תאים עצביים סיפק מידע ביולוגי חשוב, וכן הדגיש את החשיבות של לוקליזציה RNA בתכנות של מפלי ביטוי גנים. מחקר באורגניזמים אחרים ומערכות תאים הניב מידע חשוב דומה. וירוסים הם טפילים המחייבות וחייבים לנצל את התאים המארחות לשכפל. לכן, חשוב להבין כיצד וירוסים RNA לכוון את הגנום שלהם רנ"א מהגרעין, דרך נקבוביות הגרעין, דרך הציטופלסמה ועל לאחד היעדים הסופיים שלה, אל תוך חלקיקי וירוס צאצאי 1.
דגים משמש ככלי יעיל לזיהוי שינויים לוקליזציה היציב של רנ"א נגיפי. בשילוב עם immunofluorescence (IF) ניתוח 22, דגים / אם שיתוף ניתוחים יספק מידע על איתור משותף של חלבונים עם RNA ויראלי 3. ניתוח זה ולכן מהווה נקודת התחלה טובה לבדוק RNA אינטראקציות חלבון ידי ביוכימי אחר או Biophysicalבדיקות 4.5, מאז לוקליזציה שיתוף כשלעצמו אינו מספיק ראיות כדי להיות בטוח של אינטראקציה. בחקר נגיפי RNA לוקליזציה באמצעות שיטה כמו זו, מידע בשפע כבר זכה בשני אירועים נגיפיים הסלולר רנ"א סחר 6. לדוגמה, HIV-1 מייצר רנ"א בגרעין של תאים נגועים אבל RNA מתורגם רק בציטופלסמה. כאשר חלבון נגיפי המפתח חסר (חזור) 7, דג של רנ"א נגיפי גילה כי לחסום את התרבות הנגיף בשל החזקת של HIV-1 RNA הגנומי בגרעין 8.
כאן, אנו מציגים את שיטת ניתוח ויזואלי של RNA הגנומי ויראלי באתרו. השיטה עושה שימוש בדיקה RNA שכותרתו. בדיקה זו נועדה להיות משלים את RNA הגנומי ויראלי. במהלך בסינתזה חוץ גופית של RNA antisense בדיקה, ribonucleotide כי הוא שונה עם digoxigenin (DIG) נכלל במבחנה transcription התגובה. לאחר בדיקה יש הכלאה כדי mRNA המטרה בתאים, לאחר תיוג נוגדנים שלבים (איור 1) יגלה לוקליזציה של ה-mRNA, כמו גם חלבונים בעלי עניין בעת ביצוע דגים / אם.
דגים / אם שיתוף ניתוח היא שיטה אמינה לחזות רנ"א נגיפי בתאים אשר עכשיו שוכללה 9,15,16. במשך מספר שנים, פיתחנו שיטה מעודנת של מכתים עבור RNA. טכניקה זו ניתן להשתמש במגוון רחב של סוגי תאים בתנאי בדיקה ספציפית היעד RNA 17. על ידי תיוג בדיקה עם DIG, אנו מסוגלים לדמיין את הרנ"א על ידי צביעה פשוטה. כאשר מכתים עבור רנ"א וחלבונים אחרים משולבים, דגים / אם שיתוף ניתוחים להיות כלי רב עוצמה לבחון מבנים סלולריים חלבון / RNA לוקליזציה.
הספציפיות של זיהוי RNA הוא גבוה למדי. זו באה לידי ביטוי באיור 2. בחלק מן היצירה המקורית שהתמקדה לוקליזציה נגיפי RNA הגנומי, דגים קבע כי חוסר Rev לכודים רנ"א נגיפי בגרעין 18. מאז זה, המידע החדש בשפע על לוקליזציה נגיפי RNA הגנומי שהושג באמצעות techniquדואר שמתואר כאן. על ידי חלבונים overexpressing סלולריים, אוכלוסיות והן ספציפיות לא הכל של רנ"א נגיפי ניתן לכפות בתרגום לאזורים שונים של התא. Overexpression RILP, אשר דומה פנוטיפ להשיג כאשר hnRNP A2 תיגמר ידי siRNA ב-HIV-1-להביע תאים 13, גורם RNA כדי לצבור בעליל על MTOC. RNA הגנומי ויראלי יכול להיות דחף לפריפריה התא על ידי השבתת חלבון מינוס סוף המנוע, dynein: overexpression מציאה p50/Dynamitin או של כבדות dynein 1 תוצאות שרשרת שחרורו של RNA הגנומי ויראלי מתחומי תאיים לפריפריה נייד ( איור 2). מוטציה של RILP, RILPΔN, אשר לא נקשר מנוע dynein, מתפזר endosomes (מסומן על ידי LAMP1) לתוך הציטופלסמה, כי הם כבר לא פעיל מקומי בדומיינים juxtanuclear. תוצאות אלו מצביעות על הרעיון של האוכלוסייה פלסטיק של HIV-1 RNA הגנומי ובעיקר, כי בריכות שונות של הגנום-1-HIVRNA להתקיים עם התפקידים המזוהים לפעמים במחזור השכפול הנגיפי. מושגים אלה אותם כבר זיהו את החלבון המקודד על ידי ה-mRNA זה, איסור פרסום 19.
יש מגבלות על השימושים של דגים / אם שיתוף ניתוחים הקשורים הבחירה נוגדנים וזמינות. אופטימיזציה של השילוב הטוב ביותר של נוגדנים ראשוניים ומשניים, וריכוזים שלהם, ייקח זמן לבצע אופטימיזציה (ראה לוח 1 & 2). נוגדנים עשוי היברידיים או מיוצר על ידי חברות גדולות יכולות להיות ריכוזי המשתנות בכל מקום בין 01:02 ל 1:2000, אבל כדי להיות בטוח בצע את ההנחיות המסופקות על ידי היצרן לקבלת התוצאות הטובות ביותר. מארח בו את הנוגדן מיוצר צריך גם לקחת בחשבון. כבשים ערבוב עם נוגדנים עזים כמו כן, יש להימנע נוגדנים ראשוניים ומשניים כמו זה תוצאות השילוב ברקע גבוהה בשל בין המינים הכרה (מידע לא מוצג). ל-Alexa פלואוריד secondaנוגדנים ר"י, ריכוז ניתן להשתמש ב 1:500 על נוגדנים כמעט לכל קבוצה. החיסרון השני דגים / אם שיתוף ניתוחים כמתואר בדוח זה היא שהוא מתאר את RNA במיקום שלה בבית היציב, לאחר התאים תוקנו ו permeabilized באמצעות paraformaldehyde וחומרי ניקוי (איור 1).
עם זאת, RNA הדמיה בתאים חיים הושגה באמצעות מגוון רחב של אמצעי 20-22, בעיקר באמצעות וריאציות של נגיפי RNA כי הגנום מתויגים על ידי חלבוני ניאון כגון ה-GFP. עם זאת, אמצעים נוספים כדי לזהות לוקליזציה RNA בתאים חיים ממשיכים פני השטח. אלה שיטות חדשות לערב את RNA תיוג באמצעות 23 תרד, SNAP 24 או MTRIP 2. טכניקות אלו סובלים גם כמה חסרונות, כולל הדרישה permeabilize תאים לפני הוספת מצעים או מחצית חייבים להיות מהונדסים לתייג את ה-mRNA, כדי לזהות את ה-mRNA באמצעות מיקרוסקופ. אכן, אדוה גדולntage של ניתוחים דגים המפורטים בדוח זה נעוצה בעובדה כי RNA הוא יליד ללא שינוי שמוביל את התוצאות הרלוונטיות ביותר מבחינה פיזיולוגית.
The authors have nothing to disclose.
המחברים מודים לחברי בעבר ובהווה של המעבדה על תרומתו לפיתוח מתודולוגיה המפורטים כאן לאלן Cochrane עצה. בלוס אנג'לס הוא מקבל מכוני מחקר קנדי הבריאות (CIHR) מלגת דוקטורט AJM נתמך על ידי פרס פרייזר, Monat ו מקפרסון קריירה. עבודה זו נתמכת על ידי מענק מטעם CIHR (מענק # MOP-56974).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
18mm coverslips | VWR | 48380 046 | |
16% paraformaldehyde | J.T. Baker | S898-07 | To make 4%: Dissolve 20g in 500mL 1XDPBS at 60°C with 5 drops NaOH. pH to 7.2 off the heat and store at -20 °C. Do not exceed 70°C! |
Triton-X | OmniPur | 9400 | |
Micro Elute Gel Extraction Kit | Roche | D6294-02 | |
DIG RNA Labelling Mix | Roche | 11277073910 | |
Transcription T7 RNA Polymerase | Invitrogen | 18033-019 | |
Quick Spin Columns | Roche | 11814427001 | |
DNase I | Invitrogen | 18047-019 | |
1X DPBS | Gibco | 14190-250 | |
Formamide | EMD | FX0420-8 | |
tRNA | Invitrogen | 15401-021 | |
RNase OUT | Invitrogen | 10777-019 | |
Fluorescent Antibody Enhancer Set for DIG Detection #4 (blocking solution) | Roche | 1768506 | |
Alexa Fluor secondary antibodies | Invitrogen | See Table 2 | |
Hybridization Oven | Boekel Scientific | Model 24100 | |
Microslides | VWR | 48300-047 | |
Immunomount | Thermoscientific | 9990402 |
Table 1. Identification of specific reagents and equipment
Species of anti-DIG antibody (dilution; company, catalogue number) | Colours | Alexa Fluor used (1:500) |
Mouse (1:500;Sigma, B7405) | green | Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse (Invitrogen, A21202) |
red | Alexa Fluor 594 donkey anti-mouse (Invitrogen, A21203) | |
blue | Alexa Fluor 647 donkey anti-mouse (Invitrogen, A31571) | |
Sheep (1:200;Roche, 11376623) | green | Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep (Invitrogen, A11015) |
red | Alexa Fluor 594 donkey anti-sheep (Invitrogen, A11016) | |
blue | Alexa Fluor 647 donkey anti-sheep (Invitrogen, A21448) |
Table 2. Combinations of secondary antibodies and anti-DIG listed with catalogue numbers and concentrations.