Retrograd transport av fluorescerende fargestoff betegner en sub-populasjon av nevroner basert på anatomisk projeksjon. Merket axoner kan visuelt målrettet<em> In vivo</em>, Tillater ekstracellulære opptak fra identifiserte axoner. Denne teknikken letter opptak når neuroner ikke kan merkes gjennom genetisk manipulasjon eller er vanskelig å isolere ved hjelp av "blinde"<em> In vivo</em> Tilnærminger.
Det overordnede målet med denne metoden er å spille inn singel-unit svar fra en identifisert populasjon av nerveceller. In vivo elektrofysiologiske opptak fra individuelle nerveceller er avgjørende for å forstå hvordan nevrale kretser fungere under naturlige forhold. Tradisjonelt har disse innspillingene er utført 'blind', som betyr identiteten til den innspilte celle er ukjent i starten av opptaket. Cellular identitet kan deretter bestemmes via intracellulære 1, juxtacellular a eller løs-patch 3 iontophoresis av fargestoff, men disse innspillingene kan ikke være pre-målrettet mot bestemte nerveceller i regioner med funksjonsmessig heterogene celletyper. Fluorescerende proteiner kan uttrykkes i en celle-type spesifikk måte tillater visuelt guidet encellede elektrofysiologi 4-6. Men det er mange modellsystemer som disse genetiske verktøy er ikke tilgjengelig. Selv i genetisk tilgjengelige modellsystemer, den ønskede promoter kan være ukjent eller genetisk homogene nevroner kan ha ulik projeksjon mønstre. Likeledes er det virale vektorer blitt brukt til å merke spesifikke undergrupper av projeksjon nevroner 7, men bruk av denne metoden er begrenset av toksisitet og mangel av trans-synaptiske spesifisitet. Dermed er flere teknikker som tilbyr spesifikke pre-visualisering å ta opp fra identifiserte enkelt nevroner i vivo nødvendig. Previsualisering av målet neuron er spesielt nyttig for utfordrende opptaksbetingelser, for der klassisk encellede opptak ofte er prohibitivt vanskelig 8-11. Romanen teknikken beskrevet i denne artikkelen bruker retrograd transport av et fluorescerende fargestoff påføres med tungsten nåler til å raskt og selektivt merke en bestemt undergruppe av celler innenfor et bestemt hjernen regionen basert på sine unike aksonale anslag, og dermed gi en visuell kø for å få målrettede elektrofysiologiske opptak fra identifiserte nevroner i en intakt krets withina virveldyr CNS.
Det vesentligste nye fremme av foreliggende fremgangsmåte er bruken av fluorescerende merking på spesifikke celletyper i en ikke-genetisk tilgjengelig modellsystem. Svakt elektrisk fisk er en utmerket modellsystem for å studere nevrale kretser i våken, oppfører dyr 12. Vi benyttet denne teknikken til å studere sensorisk prosessering av "små celler" i fremre exterolateral kjernen (ELA) for svakt elektrisk mormyrid fisk. "Små celler" er en hypotese å være tid sammenlignende nevroner viktige for å påvise submillisecond forskjeller i ankomst ganger av presynaptiske pigger 13. Imidlertid har anatomiske trekk som tett myelin, engulfing synapser, og små celle organer gjort det svært vanskelig å ta opp fra disse cellene ved hjelp av tradisjonelle metoder 11, 14. Her kan vi vise at vår ny metode selektivt betegner disse cellene i 28% av forberedelser, slik at for pålitelige og robuste innspillinger og pregetrization tiltak mot electrosensory stimulering.
Når mestret, vil denne teknikken tillater en å målrette identifiserte nevroner, inkludert individuelle axoner, for in vivo-innspillinger i mange modellsystemer. I tillegg gir denne teknikken en å pålitelig spille pigg utgang fra nevroner med unike anatomiske egenskaper som gjør tradisjonell in vivo opptak metoder utfordrende. Vi har brukt denne teknikken for å ta opp fra ELA "små celler" i mormyrid svakt elektrisk fisk. Tidligere forsøk på å studere tuning egenskapene til "små celler" var mislykket på grunn av utfordrende opptaksforhold 11, 14. Lignende anatomiske trekk skape hindringer for å skaffe enkelt enhet opptak fra mange forskjellige virveldyr auditive og electrosensory nevroner 8-10. For å overvinne disse utfordringene i vårt system, vi tok fordel av det faktum at "små celler" er de eneste cellene i ELA at prosjektet til ELP. Dermed begrenser retrograd transport av fargestoff plassert i ELP merking i ELA til "smallcelle "Somas og aksoner. Fluorescent merking av axoner tillatt presis plassering av elektrodene ved siden av merket axoner, noe som gjør enkelt enhet opptak fra identifiserte celler mulige tross utilgjengelige Somas. Vi forsøkte somatiske innspillinger, men var mislykket, trolig på grunn av de omkringliggende Engulfing synapser 11 , 17.. Imidlertid var somatisk merking klart synlig som tyder på at denne teknikken kan brukes til å målrette somatiske opptak i andre celletyper og andre kretser. fluorescerende merking av nevroner gjennom retrograd transport in vivo har vært brukt for å styre målrettede opptak in vitro 19-21 . En lignende teknikk ble brukt for målrettet in vivo opptak fra motoriske nerveceller i sebrafisk ryggmargen 22. Vårt arbeid representerer en ny utvidelse av denne tilnærmingen, der både merking og opptak er gjort i vivo i hjernen. Vår metode viser at in vivo merking av CNS-områder med en retrograd tracer kan utvides til studiet av andre intakte kretser med samme selektive projeksjon nevroner. For eksempel, i pattedyr auditiv prosessering, serverer dårligere colliculus (IC) som en viktig stafett senter for innspill fra flere rhombencephalic strukturer 23. Dye injeksjon i IC ville selektivt merke projeksjon celler fra hver av disse kjerner. Den overlegne colliculus (SC) serverer en lignende funksjon for visjonen 24. Ryggmargen preparater er spesielt godt egnet for denne teknikken, som ryggmargen er lett tilgjengelig, kan fargestoff injeksjon oppstå langt fra innspillingen området, og det kan kombineres med intracellulære opptak og fylling av utvalgte nerveceller til å skaffe mer detaljert anatomisk informasjon 25. Endelig er tarmkanalen-tracing en veletablert teknikk som brukes gjennom hele det sentrale nervesystemet å kartlegge kompleks krets 26.. Vår fremgangsmåte kan benyttes til å legge funksjonell informasjon til disse studier som har blitt utført wed kalsium-sensitive indikatorer i cat visuell cortex 27.
Operasjonen, som er godt etablert og pålitelig, og blir brukt til blind in vivo opptak 16, må være utført med minimal blødning og ingen skade på overflaten av hjernen for å tillate dyret og vev å overleve. Med praksis, kan operasjonen og dye-programmet være ferdig i 30-45 minutter. Vi lykkes merket "småcellet" axoner i 67% av forberedelsene. De fleste preparatene har bare en eller to synlige merket axoner, men noen har så mange som åtte. Av de 119 merkede enheter forsøkt, fikk vi enkelt enhet innspillinger fra 26 enheter fordelt på 12 preparater (tabell 2). Dermed ble data samlet inn fra 41% av preparater med merket axoner for en samlet suksessrate på 28%.
Den kritiske aspektet av fargestoff søknaden merking dybde. Grunt innsetting av wolfram ledning vil resultere i fargebad blir vasket away. Imidlertid, hvis inntrengning er for dypt, vil merket axoner ikke være synlig for målretting. Videre må noen mekanisk skade på cellen forekommer for fargestoffet for å være tilstrekkelig tatt opp 25, 28. Imidlertid vil for mye skade drepe cellene. Vi forsøkte merking med andre fargestoffer og andre metoder (tabell 2), inkludert anterograde merking gjennom fargestoff injeksjon i ELA sammen med opptak fra merket axoner i ELP (Tabell 3). Vi hypotese at anterograde merking ikke var vellykket fordi merking var begrenset til celler med somatisk skade, noe som gjør dem svarer. Dessuten kan pre-synaptiske terminaler har blitt forstyrret. I motsetning til dette, reduserer retrograd merking begge disse bekymringer. Mengden og plassering av fargestoff søknad kan endres i henhold til den spesielle krets som studeres. Maximal merking skjer med størst fargestoff konsentrasjon, som vi oppnådd ved hjelp av belagte tungsten ledninger. Imidlertid for merking med de axonerep anslag, kan dye kommet av en tungsten nål som det er avansert. I disse tilfellene, ville press injeksjon være mer hensiktsmessig. Dye opptak og transport er rask, med merket axoner i vår forberedelse blir synlig så tidlig som to timer etter injeksjon og ytterligere merket aksoner vises så sent som seks timer etter injeksjon. Således kan merking og opptak oppnås på en enkelt dag, eliminerer tekniske vanskeligheter forbundet med å overleve operasjonen. Timing vil variere for hvert program avhengig av avstanden kreves for dye transport.
Et annet viktig aspekt er elektrodeplasseringen. Det er viktig å gå inn i vev i nærheten av det området av den merkede axon for å hindre tilstopping av tuppen. For tett vev som i ELA, minimerer en lang, tynn skaft på innspillingen elektroden overflødig bevegelse av omkringliggende vev. Hvis en vellykket opptak ikke er oppnådd på første forsøk, gjenta med ferske elektroder til et opptak er oppnådd eller tissue er forstyrret til det punkt hvor axon ikke lenger er synlig. Imidlertid er det også viktig å raskt plasseres elektroden ved siden av axon å minimere mengden av fluorescerende eksponering, noe som kan føre til fototoksisitet, bleking og kan påvirke fysiologiske egenskaper av cellen 29-31.
Når et segment av axon er vellykket suges inn i opptaket elektrode, kan opptak fås i flere timer. Hvis enhetene er gjennomgående tapt på mindre enn en time, bør du vurdere å gjøre mindre elektrodespissene å hindre axon sklir ut. På den annen side kan for liten til en dyse resultere i tilstopping og lav signal-til-støy, eller skade på axon. En jevn nedgang i pigg amplitude og "avkastningen" av en enhet med ekstra sug er en indikasjon på at spissen er for stor. For mye suging kan forårsake uopprettelig skade på aksonet. En løsning er å tillate at en liten lekkasje i luftledningen slik at trykket langsomt går tilbake til null. Raskt utjevne the press vil føre til en forbigående relativ-utover "push" som kan utvise axon.
Selv om denne teknikken representerer en stor fordel for oppnåelse av målrettet opptak fra identifiserte projeksjon nevroner, vil det ikke være nyttig for å skille lokale interneuroner, som fargestoff ville bli tatt opp av alle celletyper ved injeksjonsstedet. Teoretisk kan bruk av flere fluorophores med separate injeksjonssteder tillate denne metoden til å bli utvidet. For eksempel kan sammenligningen av enkelt-versus dobbel merking brukes til å skille interneuroner fra projeksjon nevroner etter dobbel injeksjoner ved to punkter i kretsen 32.. På samme måte kan retrograd sporstoff kombineres med andre avanserte imaging teknikker, for eksempel to-foton bildebehandling, som ble gjort nylig i Sebrafink Høy Vocal sentrum (HVC) 32. Dessuten er opptak regioner begrenset til de nær overflaten ved bruk epifluorescence mikroskoper, som vi var bare i stand til å løse en μ moh strukturer innenfor de første 30 mikrometer vev. Imidlertid kan denne dybde utvides gjennom bruk av andre mikroskopi-teknikker, for eksempel to-foton mikroskopi 33 eller objektiv-koblet plane belysning mikroskopi 34.. Samlet sett representerer denne teknikken et viktig fremskritt i studiet av nevrale kretser i vivo fordi det kan brukes til å ta opp fra én nevroner i mange ulike kretser i en rekke modellsystemer – inkludert de som er relativt utilgjengelig.
The authors have nothing to disclose.
Finansiering levert av National Science Foundation (IOS-1050701 til BAC), National Institutes of Health (NS54174 til SM og F30DC0111907 til AML-W.), Den Uehara Memorial Foundation og Japan Society for Promotion of Science (G2205 til TK ). Vi takker Julian Meeks for hans støtte og veiledning på temaet ekstracellulære aksonale innspillinger. Vi takker Carl Hopkins for å gi en prototype opptak kammer.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Tricaine Methanesulfonate | Sigma-Aldrich | E10521 | MS-222 |
Gallamine Triethiodide | Sigma-Aldrich | G8134 | Flaxedil |
Lidocaine Hydrochloride | Sigma-Aldrich | L5647 | |
Hickman’s Ringer Solution | NA | NA | NaCl (6.48 g/l), KCl (0.15 g/l), CaCl2•2H20 (0.29 g/l), MgSO4 (0.12 g/l), NaHCO3 (0.084 g/l), NaH2PO4 (0.06 g/l) |
Peristaltic Pump | Gilson or Rainin | Minipulse 3 Model 312; RP-1 | 10.0 ± 1.0 rpm, Alternatively, a gravity-fed line with a flow-meter |
Dissection Microscope | Nikon | SM2645 | |
Super Glue | Super Glue Corporation | SGH2 | 2g tube |
Omni Drill 35 | World Precision Instruments | 503-598 | |
Ball Mill Carbide Drill Bit #1/4 | World Precision Instruments | 501860 | 0.19 DIA (bit diameter = 0.48 mm) |
Low Temp Cautery Kit | World Precision Instruments | 500391 | |
Manual Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
Dextran Conjugated Alexa Fluor 568 | Invitrogen | D-22912 | 2mM concentration; 10,000MW The choice of dye wavelength should be selected to match the microscope filter settings |
Epifluorescent Microscope | Nikon | E600 FN | A remote focus accessory is helpful for fine focus TRITC filter – or appropriate filter to match focal planes for different dye wavelengths |
Low Power Objective | Nikon | 93182 | CFI Plan Achromat Series, 4X N.A. 0.1, W.D. 30mm |
High Power Objective | Nikon | 93148 | CFI Fluor Series, 40X WI N.A. 0.8, W.D. 2.0 mm |
White Light Source | Dolan-Jenner | Model 190 | Fiber Optic Illuminator |
Fluorescent Light Source | Lumen Dynamics | X-Cite 120Q | |
Low-light Level Camera | Photometrics | CoolSnap ES | |
Digital Manometer | Omega Engineering | HHP-201 | |
Motorized Micromanipulator | Sutter Instruments | MP-285 | |
Headstage | Molecular Devices | CV-7B | Axon Instruments |
Amplifier | Molecular Devices | MultiClamp 700B | Axon Instruments |
Data Acquisition System | Molecular Devices | Digidata 1322A | Axon Instruments |
Isolated Pulse Stimulator | A-M Systems | 2100 | |
Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | Program settings for our application: Heat: ramp + 1, Pull: ‘0’, Velocity: 60, Time: 90 Box filament |
Pipette Glass | World Precision Instruments | 1B100F-4 | Borosilicate capillary glass with filament (1 mm OD, 0.58 mm ID) |