العزلة وتحليل الجينوم Virions واحدة باستخدام 'جينوم فيروس واحد'
Summary
علم الجينوم فيروس واحد (SVG) هو وسيلة لعزل وتضخيم الجينوم من virons واحد. يتم تصنيف معلقات الفيروسية من تجمع مختلط باستخدام التدفق الخلوي على شريحة المجهر مع آبار منفصلة تحتوي على الاغاروز، وبالتالي الاستيلاء على الفيريون والحد من قص الجينوم أثناء التجهيز النهائي. ويتم تحقيق كامل الجينوم التضخيم متعددة باستخدام التضخيم التشرد (MDA) مما أدى إلى المواد الجينية التي هي مناسبة لتسلسل.
Abstract
كامل الجينوم التضخيم وتسلسل الخلايا الميكروبية واحدة تمكن توصيف الجيني من دون الحاجة إلى زراعة 1-3. الفيروسات، والتي هي في كل مكان والكيانات الأكثر عددا على كوكبنا 4 وهامة في جميع البيئات 5، لم يتم الكشف عنها عن طريق نهج مماثلة. نحن هنا وصف نهج لعزل وتوصيف العوامل الوراثية من virions واحد يسمى "علم الجينوم فيروس واحد '(SVG). SVG تستخدم التدفق الخلوي لعزل الفيروسات الفردية والتضخيم كله الجينوم للحصول على ارتفاع الوزن الجزيئي الحمض النووي الجيني (gDNA) التي يمكن استخدامها في التفاعلات التسلسل اللاحقة.
Protocol
Discussion
يجب اتخاذ عدد من العوامل الهامة في الاعتبار عند تطبيق النهج SVG. التنميط الجيني، كما تم تنفيذ خلال إثبات صحة مفهوم التجربة 13، ليس خيارا صالحا للعزلة البيئية أو غير معروف كما الاشعال الحفظ غير متوفرة في جميع الفئات الفيروسية. أيضا، يتم الإبلاغ خلفية توليف الحمض ا?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونود أن نشكر كين نيلسون لبصيرته والمشورة في جميع مراحل عملية إعداد المخطوطة.
Materials
| Material Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| 1X TE buffer | Invitrogen | 12090-015 | |
| Buffer-saturated Phenol | Invitrogen | 15513-039 | |
| GenomiPhi HY kit | GE Healthcare | 25-6600-22 | |
| Glycoblue | Invitrogen | AM9516 | 15 mg/ml |
| LMP agarose | Invitrogen | 16520100 | |
| PTFE microscope slide | Electron Microscopy Sciences | 63430-04 | 24 well, 4 mm Diameter |
| SybrGreen | Invitrogen | S7585 | 10,000X |
| β-agarase | New England Biolabs | M0392S |
Referencias
- Raghunathan, A., et al. Genomic DNA amplification from a single bacterium. Appl. Environ. Microbiol. 71, 3342-337 (2005).
- Lasken, R. S. Single-cell genomic sequencing using Multiple Displacement Amplification. Curr. Opin. Microbiol. 10, 510-516 (2007).
- Ishoey, T., Woyke, T., Stepanauskas, R., Novotny, M., Lasken, R. S. Genomic sequencing of single microbial cells from environmental samples. Curr. Opin. Microbiol. 11, 198-204 (2008).
- Edwards, R. A., Rohwer, F. Viral metagenomics. Nature Reviews Microbiology. 3, 504-510 (2005).
- Rohwer, F., Prangishvili, D., Lindell, D. Roles of viruses in the environment. Environ. Microbiol. 11, 2771-2774 (2009).
- Williamson, S. J., et al. The Sorcerer II Global Ocean Sampling Expedition: metagenomic characterization of viruses within aquatic microbial samples. PLoS ONE. 3, e1456 (2008).
- John, S. G., et al. A simple and efficient method for concentration of ocean viruses by chemical flocculation. Environ. Microbiol. Rep. 3, 195-202 (2011).
- Noble, R., Fuhrman, J. Use of SYBR Green I for rapid epifluorescence counts of marine viruses and bacteria. Aquat Microb Ecol. 14, 113-118 (1998).
- Hara, S., Terauchi, K., Koike, I. Abundance of viruses in marine waters: assessment by epifluorescence and transmission electron microscopy. Appl. Environ. Microbiol. 57, 2731-2734 (1991).
- Hennes, K. P., Suttle, C. A. Direct counts of viruses in natural waters and laboratory cultures by epifluorescence microscopy. Limnol. Oceanogr. 40, 1050-1055 (1995).
- Marie, D., Brussaard, C. P. D., Thyrhaug, R., Bratbak, G., Vaulot, D. Enumeration of marine viruses in culture and natural samples by flow cytometry. Appl. Environ. Microbiol. 65, (1999).
- Brussaard, C. P. Enumeration of bacteriophages using flow cytometry. Methods Mol. Biol. 501, 97-111 (2009).
- Allen, L. Z., et al. Single Virus Genomics: A New Tool for Virus Discovery. Plos One. 6, (2011).
- Hutchison, C. A., Smith, H. O., Pfannkoch, C., Venter, J. C. Cell-free cloning using phi 29 DNA polymerase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 17332-17336 (2005).
