Emme Pipet Tekniği kullanılarak Olfaktör Reseptör Nöronlar Kaydedilmiş odorant bağlı Cevapları
Summary
Olfaktör reseptör nöronları (ORNs) bir reseptör içine ilk sırayla koku ampul içinde ikinci dereceden nöronlara iletilir aksiyon potansiyelleri tetikleyen güncel koku sinyalleri dönüştürmek. Burada aynı anda odorant bağlı reseptör fare ORNs mevcut ve aksiyon potansiyelleri kaydetmek için emme pipet tekniği tarif.
Abstract
Hayvanlar burun boşluğunda bulunan kimyasal duyusal sistemleri aracılığıyla çevrelerindeki kokulu ortamda tadabilirsiniz. Kimyasal duyusal sinyaller gibi yiyecek seçimi, yırtıcı, conspecific ve eşini tanıma ve diğer sosyal ilgili ipuçları gibi karmaşık davranışları etkiler. Olfaktör reseptör nöronları (ORNs) olfaktör epitel gömülü nazal kavite dorsal kısmında yer almaktadır. Bunlar bipolar nöronların (bkz. Şek. 1, başlangıçta Genel Fizyoloji Dergisi'nde yayınlanan Reisert & Zhao 1) koku ampul bir akson göndermek ve koku kaplayan mukus içine nereye kirpikler yayar gelen epitelyal sınırına tek bir dendrit uzatmak epitel. Kanal (Şekil 1) – tüyler sonuçta silier transdüksiyonu kanalları, siklik nükleotid-geçiş (CNG) kanal ve bir Ca2 + ile aktive Cl arasından akım akışına neden olmaktadır eksitatör sinyal transdüksiyonu amaçlı içerir. Ensuing depolazasyon hücre gövdesi 2-4 aksiyon potansiyeli oluşturma tetikler.
Bu videoda ORNs gelen odorant bağlı yanıtları kaydetmek için "emme pipet tekniği" kullanımını açıklar. Bu yöntem ilk çubuk fotoreseptör 5 kayıt yapmak geliştirilmiş ve bu yöntem bir varyantı fare koni fotoreseptör 6 kaydetmek için modifiye jove.com bulunabilir. Emme pipet tekniği daha sonra da ORNs 7,8 kayedetmek uyarlanmıştır. Kısaca, koku ve epitel hücre izolasyon ayrışma takiben, ORN, tüm hücre gövdesi bir kayıt pipet ucu içine çekilmektedir. Dendrit ve kirpikler banyo solüsyonu maruz ve örneğin odorant veya farmakolojik engelleyici uygulamayı etkinleştirmek için çözüm değişiklikleri böylece erişilebilir kalır. Bu yapılandırmada, intraselüler çevreye hiçbir erişim elde edilir (hayır tam hücreli gerilim kelepçe) ve hücre içi voltajı değişir serbest kalır. Bu, tümkirpikler ve hücre gövdesi 9 tarafından ateş hızlı aksiyon potansiyelleri de kaynaklanır yavaş reseptör akımı eş zamanlı kayıt OWS. Bu iki sinyal arasında kinetikleri farkı da farklı filtre ayarları kullanılarak ayrılması için olanak sağlar. Bu teknik, her vahşi tip ya da knockout farelerde kullanılabilir veya aynı zamanda ORNs belirli alt etiket GFP ifade ORNs dan seçici olarak kaydetmek için, örneğin, belirli bir odorant reseptör veya iyon kanalı eksprese eden.
Protocol
Discussion
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma NIH DC009613, İnsan Sınır Bilim Programı ve Morley Bakım Bursu (JR) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name of the material | Tipo | Company | Catalogue / Model number |
Comments |
| Air table | equipment | Newport | ||
| Air Pump | equipment | Newport | ACGP | |
| Pipette Puller | equipment | Sutter | P-97 | |
| Borosilicate glass | equipment | WPI | 1B150-4 | |
| Nikon Eclipse Inverted microscope | equipment | Nikon | TE2000U | Equipped with Hg lamp, GFP filter and objectives 20X and 5X at least |
| Amplifier PC-501A | equipment | Warner | 64-0008 | Headstage 1 GΩ |
| Diamond knife | Equipment | Custom-made | ||
| Digitizer Mikro1401 A/D | equipment | Cambridge Electronic Design | ||
| Filter unit 3382 | equipment | Krohn Hite corporation | ||
| Signal | software | Cambridge Electronic Design | ||
| Molded Ag/AgCl Pellet | equipment | WPI | 64-1297 | |
| Pipette holder | equipment | Warner | 64-0997 | Custom modified to fit headstage |
| Recording chamber | Equipment | Custom-made | ||
| Micromanipulator MP85-1028 |
equipment | Sutter Instrument | Micromanipulator MP85-1028 |
|
| Mineral oil | Solution | Sigma | 330779-1L | |
| Oscilloscope TDS 1001 | equipment | Tektronix | ||
| Three-barreled square glass tube | Equipment | Warner | 64-0119 | 0.6 mm ID , 5 cm long |
| Valve | equipment | The Lee Company | ||
| Valvelink 8.2 | equipment | Automate Scientific | ||
| SF-77B Perfusion fast step | equipment | Warner |
Referencias
- Reisert, J., Zhao, H. Perspectives on: Information and coding in mammalian sensory physiology: Response kinetics of olfactory receptor neurons and the implications in olfactory coding. J. Gen. Physiol. 138, 303-310 (2011).
- Kaupp, U. B. Olfactory signalling in vertebrates and insects: differences and commonalities. Nat. Rev. Neurosci. 11, 188-200 (2010).
- Tirindelli, R., Dibattista, M., Pifferi, S., Menini, A. From pheromones to behavior. Physiol. Rev. 89, 921-956 (2009).
- Kleene, S. J. The electrochemical basis of odor transduction in vertebrate olfactory cilia. Chem. Senses. 33, 839-859 (2008).
- Baylor, D. A., Lamb, T. D., Yau, K. W. Responses of retinal rods to single photons. J. Physiol. 288, 613-634 (1979).
- Wang, J., Kefalov, V. J. Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors. J. Vis. Exp. (35), e1681 (2010).
- Lowe, G., Gold, G. H. The spatial distributions of odorant sensitivity and odorant-induced currents in salamander olfactory receptor cells. J. Physiol. 442, 147-168 (1991).
- Reisert, J., Matthews, H. R. Na+-dependent Ca2+ extrusion governs response recovery in frog olfactory receptor cells. J. Gen. Physiol. 112, 529-535 (1998).
- Reisert, J., Matthews, H. R. Adaptation of the odour-induced response in frog olfactory receptor cells. J. Physiol. 519, 801-813 (1999).
- Matthews, H. R. A compact modular flow heater for the superfusion of mammalian cells. J. Physiol. 518P, 13 (1999).
- Reisert, J., Matthews, H. R. Simultaneous recording of receptor current and intraciliary Ca2+ concentration in salamander olfactory receptor cells. J. Physiol. 535, 637-645 (2001).
