Método para el aislamiento e identificación de mRNAs, microRNAs y componentes proteicos de ribonucleoprotein complejos de extractos celulares usando RIP-Chip

Experimento preparación Antes de comenzar el experimento, es crítico tener todos los reactivos, recipientes y utensilios libre de RNasa. Tratar cristalería con inhibidor de RNasa (RNaseZAP, Ambion) seguido de aclarado con agua tratada con DEPC. Asegúrese de que todos los reactivos se confirman como RNasa libre. 1. Preparar mRNP Lysate Cultivar y cosechar las células del tejido que crecen exponencialmente a producir entre 2-5 mg de proteína total de cada RIP. Dos P150 placas de cultivo suelen ser suficientes. Para cada RBP está investigando, el total de las cantidades celulares número y proteína debe ser optimizada para maximizar ARNm diana apropiada y las interacciones PER. RIP para QRT-PCR análisis puede requerir lisado celular menos (aproximadamente 400 g de proteína total), debido a su amplificación y método de detección especialmente para las prácticas comerciales restrictivas alta abundancia tales como HuR, AUF1, TIAR. </Li> Precipitar las células mediante centrifugación a 200 xg durante 8-10 min a 4 ° C, luego lavar tres veces con PBS enfriado con hielo. Después del lavado final, dé golpecitos en la parte inferior del tubo y se resuspende el sedimento celular en volúmenes iguales de tampón de lisis preparada polisomas (PLB) con inhibidores de proteasa y RNasa. Se recomienda medir el volumen exacto del sedimento celular. Suavemente pipeta de mezcla (no vórtex) para separar las matas de células lisado y se incuba en hielo durante 5 min. Se centrifuga a 13.000 xg durante 20 min a 4 ° C para eliminar el lisado de los desechos. Transferir inmediatamente aclaró sobrenadante a un tubo de microcentrífuga pre-enfriado. Mantener en hielo y se almacena a -80 ° C. Inmediatamente la congelación completa la lisis apropiado de las células y previene la unión no deseada. Proceda con deshielo RIP muestra inmediatamente siguiente y mantener las muestras en hielo para evitar la degradación del ARN. </Li> Este lisado se puede almacenar durante hasta seis meses a -80 ° C. Evitar ciclos repetidos de congelación y descongelación ya que esto puede dar lugar a proteínas y / o degradación del ARNm. Cuantificar la concentración de proteínas en el lisado utilizando estándar de ensayo de proteínas de Bradford. 2. Proteína de la cubierta A Sepharose bolas con anticuerpos y Wash Pre-oleaje de proteína A Sepharose (PAS) las perlas durante la noche en tampón NT2 (volúmenes 3-4) con 5% de BSA. Almacenar a 4 ° C. El almacenamiento a largo plazo de hasta varios meses a 4 ° C es posible cuando se suplementa con azida sódica al 0,1%. Perlas de Sepharose proteína debe ser elegido sobre la base de isotipo de anticuerpo diana RBP. Las proteínas A y G, y A / G todos tienen objetivos específicos de isotipo y variar en la afinidad de destino. Proteína A Sepharose perlas se utilizaron basa en la especificidad de isotipo y la afinidad por anticuerpo de proteína HuR. Antes de uso, eliminar el tampón NT2 exceso, por loque las cuentas finales al ratio de amortiguación es de 1:1. El uso de 1,5 ml RNasa libre de tubos de microcentrífuga, eliminar el 100 l de suspensión de PAS y añadir 30 g de anticuerpo para cada reacción IP individual (es decir, específica y las prácticas comerciales restrictivas de control de isotipo). Añadir 100-200 l de tampón NT2 para anticuerpo mezcla de microesferas. Mezcla puede conservarse durante varias semanas a 4 ° C cuando se suplementa con azida sódica al 0,1%. Un anticuerpo isotipo o suero normal de las mismas especies conjunto se debe utilizar en paralelo como un control de anticuerpo contra ARN fondo. Añadir anticuerpo apropiado para mezcla de microesferas y se incuba durante la noche, dando tumbos extremo sobre extremo a 4 ° C. Optimizar el título de anticuerpos para la proteína específica que se está investigando (g 1, 5, 10 o 30 de anticuerpo es generalmente suficiente). Preparar perlas recubiertas con anticuerpo inmediatamente antes de su uso mediante lavado con 1 ml deenfriado con hielo NT2 tampón 5 veces. Lavar mezcla de perlas por centrifugación a 13.000 xg durante 1-2 min a 4 ° C. Retire con cuidado la cantidad máxima de sobrenadante con pipeta o aspirador de mano, pero tenga cuidado de no perturbar pellet. Lavar ayuda a eliminar el anticuerpo no unido, así como contaminantes de RNasa mezcla de anticuerpos. Una vez que el lavado final se ha completado, resuspender las perlas en 700 l de tampón enfriado con hielo NT2 seguido de tratamiento con diversos inhibidores de RNasa para proteger a los ARNm diana, incluyendo 10 l de RNasa a cabo a 40 U / l, 10 l de 100 mM DTT y 15 l de EDTA (15 mM). Se ajusta el volumen a 1.000 ml con tampón NT2. Complejos de vanadilo ribonucleósidos no se utilizan debido a un efecto inhibidor de EDTA. 3. Inmunoprecipitación y precipitación del ARN Paso preclaro Opcional: Para reducir el fondo, las perlas y el anticuerpo de control puede ser usado para pre-lisado claro. Esto puede reducir la señal en la salida. Este paso puede ser necesario para reducir el fondo cuando se hace IP seguido por microarray. Generalmente, no es necesario que IP seguida por QRT-PCR. Preclear con 15 g de isotipo de control durante 30 min / 4 º C final cayendo sobre el extremo. Añadir 50 l de perlas preswollen PAS no recubiertas con anticuerpos del paso 2.1. Incubar 30 min / 4 º C con rotación sobre el extremo final Centrifugar a 10.000 xg a 4 ° C. Guardar el sobrenadante por IP. Añadir 100 l de lisado aclarado aislado (aproximadamente 2-5 mg) a la mezcla de anticuerpos preparada. La dilución de lisado ayudará a reducir el fondo y la unión no específica. Cantidad de entrada de lisado puede variar dependiendo del método de detección y la abundancia de RBP or eficiencia de anticuerpo RBP como se indica en el paso 1.1.c. (Opcional) Añadir inmediatamente tubo suavemente agitando varias veces seguidas por breve centrifugación a 10.000 xg a 4 ° C con perlas de pellets y retirar inmediatamente 100 l de sobrenadante como una representación de entrada total de ARNm para el análisis de qPCR utilizando técnicas estándar de aislamiento de ARN. Este paso es confirmar que la entrada de lisado de ARN es óptimo para IP y sólo debe realizarse como un paso de verificación o como un paso de solución de problemas siguiendo RIP con pobres resultados de ARN. Wrap tubo en parafilm para asegurar el cierre hermético y se incuba a 4 ° C durante 2 a 4 horas, cayendo de punta a punta. Timing en incubación debe ser optimizado basado en la abundancia de destino y debe reducirse al mínimo para evitar reordenamiento complejo o degradación. Para algunas prácticas comerciales restrictivas incubaciones más cortos pueden ser más óptima. Pellet cuentas a 5.000 XGFo 5 min a 4 ° C y guardar el sobrenadante para el análisis del potencial por Western blot. Tienda de alícuotas a -80 ° C. Las alícuotas de sobrenadante con altas cantidades de proteína diana residual puede indicar un fallo de la proteína a ser precipitada por perlas de sefarosa. Como se ha descrito anteriormente, lavar perlas de 5 veces con 1 ml de tampón enfriado con hielo NT2 y centrifugación (5.000 xg durante 5 min a 4 ° C) y luego eliminar el sobrenadante con pipeta de mano o un aspirador. Métodos de lavado más rigurosas pueden ser utilizados con el fin de reducir el fondo, completándolo NT2 tampón con desoxicolato de sodio, urea o SDS. Mantener las muestras en hielo tanto como sea posible y trabajar con rapidez para minimizar la degradación de ARNm diana. Opcional: Guardar una pequeña alícuota (10%) de mezcla de perlas o ejecutar una muestra adicional en paralelo para comprobar la eficacia de IP proteína diana usando análisis de transferencia Western. 4. DNasa y Tratamientos proteinasa K Después del lavado, se resuspenden las perlas con 100 l de tampón NT2 suplementado con 5 l de RNasa libre de DNasa 1 (2 U / l). Mantener a 37 ° C durante 5-10 minutos. Añadir 1 ml de tampón NT2 y centrifugar a 5.000 xg durante 1 min a temperatura ambiente. Un pequeño (~ 10%) alícuota de perlas se puede utilizar para comprobar la eficiencia de IP por análisis de SDS-PAGE. Resuspender el pellet en 100 PAS l tampón NT2, 5 l de proteinasa K (10 mg / ml), y 1 l 10% de SDS. Incubar la mezcla resuspendida de cuentas durante 30 min a 55 ° C en un baño de agua, agitando suavemente en cada 10 min. Proteinasa K ayudará en la liberación de los componentes RNP. Pellets perlas a 5.000 xg durante 5 min a temperatura ambiente (RT) y recoger el sobrenadante (~ 100 l). Añadir 200 l NT2 tampón a las perlas, centrifuge 5.000 xg durante 2 min a TA, recoger el líquido sobrenadante (~ 200 l), y perlas de descarte. Combine sobrenadantes (100 l y l 200) y añadir 300 l capa inferior de ácido fenol-CHCl 3. Vortex, 1 min RT (o 37 ° C en agitador) y se centrifuga a 16.000 xg a TA durante 1 min. Tomar 250 l de capa superior (NO interrumpir interface), se añaden 25 l de acetato de sodio a pH 5,2, 625 l 100% ETOH y 5 glycoblue l, y mezclar bien. Almacenar durante la noche a -20 ° C. Para asegurar la recuperación adecuada de ARN, la adición de glycoblue aumentará la visibilidad de la ARN precipitado al actuar como una molécula portadora. El día siguiente, los tubos se mezcla por inversión 3-5 veces, centrifugado a 12.000 xg a 4 ° C durante 30 min y descartar el sobrenadante. Añadir 1 ml de EtOH al 70% a la pastilla azul y mezclar por inversión o agitación con vórtex. Centrifugar 12.000 xg a 4 ° C durante 2 min. Discard sobrenadante y centrifugar 12.000 xg durante 1 min a 4 ° C. Eliminar cualquier ETOH residual 70% con una pipeta y el aire de gránulo seco a temperatura ambiente durante 5 min. Resuspender en 20-40 l de RNasa / DNasa libre de agua o de otro volumen apropiado según sea necesario. Muestra está ahora lista para otras aplicaciones posteriores tales como QRT-PCR o microarrays. Espectrofotometría Nanodrop se puede utilizar en la evaluación de la concentración de la muestra, sin embargo, con preciosas muestras, puede ser beneficioso para evitar muestras nanodropping como puede ser un desperdicio y relativamente inexacta. Sugerimos a normalizar las muestras transcripciones de genes de limpieza para evaluar la pureza y la eficiencia de rendimiento IP para muestras preciosas o baja. 5. Los resultados representativos Si el procedimiento se optimiza y se realiza correctamente, la inmunoprecipitación debe producir enriquecimiento significativo de mRNA objetivos. Típicamente, Dependiendo de la RBP y su ARNm objetivo (s), vemos enriquecimiento de aproximadamente 10 – a 50-veces cuando se evaluó mediante qRT-PCR. Muchos objetivos de las prácticas comerciales restrictivas pueden ser descubiertos de forma masiva mediante el análisis de microarrays. Sin embargo, este método es más sensible a la degradación en comparación con QRT-PCR. Dependiendo de la RBP, el número de objetivos y la eficiencia de la reacción, microarray puede revelar cientos de nuevas dianas, o sólo puede descubrir unos pocos, si los hay. Por ejemplo, uno de los mejor caracterizados ARN proteínas de unión HuR, post-transcriptionally regula la expresión y traducción de muchos genes fisiológicos importantes 1, 2. Aislamiento de la HuR-ribonucleo-complejo a través de RIP-Chip mama en las líneas celulares de cáncer, por ejemplo, reveló el enriquecimiento de varios objetivos importantes Hur conocidos, incluyendo β-actina utilizando QRT-PCR como se muestra en la figura 1. En ambas líneas celulares de cáncer de β-actina se enriquece 12 – a 15-veces. Por lo general, cuando se realiza correctamente, vemos un significativo enrichment de β-actina en una variedad de líneas celulares. Sin embargo, si el RIP no revela ningún enriquecimiento significativo para la β-actina esto indica un problema con el PIR y el procedimiento puede ser necesario repetir. Por otra parte, el análisis de microarrays de muestras inmunoprecipitadas de estas líneas celulares reveló subconjuntos distintos de expresión de los objetivos de Hur en el receptor de estrógeno (ER diferente) de células positivas MCF-7 de cáncer en comparación con ER negativos MB-231 líneas celulares de cáncer de mama como se muestra en la Figura 2 1. Estos objetivos se dividen en varias categorías: objetivos Hur conocidos y desconocidos que estaban asociados ya sea o no relacionado con el cáncer. Por ejemplo, CALM2 y CD9 son ambos genes del cáncer que no habían sido identificados como objetivos Hur. Uso del microarray y confirmar con QRT-PCR, CALM2 y CD9 se encontró que 5 – a 180-veces enriquecido en el sedimento HuR indicando una interacción entre la proteína prominente HuR y estos genes objetivo. <img src = "/ files/ftp_upload/3851/3851fig1.jpg" alt = "Figura 1" /> Figura 1. Inmunoprecipitación y RIP en MB-231 (ER-) y MCF-7 (ER +) células de cáncer de mama. Inmunoprecipitaciones se realizaron a partir de MB-231 o MCF-7 lisados ​​celulares usando anticuerpos anti-Hur anticuerpo monoclonal (3A2) y de control de isotipo IgG1. A. propiedad intelectual occidental de Hur reveló banda esperaba tamaño detectado por 3A2. Panel de la derecha revela cantidades de HuR en lisados ​​de entrada utilizado de ambas líneas celulares, con β-tubulina como control de carga. B. Verificación por cuantitativos RT-PCR mostró quince y once veces enriquecimiento de β-actina, un objetivo Hur conocido, en los proyectos de investigación 3A2 de MB-231 y MCF-7, respectivamente. Todos los valores se normalizaron a ΔΔCT GAPDH. Los experimentos se realizaron por duplicado (n = 2). Figura 2. Hur RIP-CHIP identifica distintos perfiles genéticos en ER + y ER-células de cáncer de mama.Hur inmunoprecipitaciones se realizaron a partir de MB-231 o MCF-7 de células lisados ​​utilizando anticuerpo HuR y control de isotipo IgG1 hibridó a Illumina matrices Sentrix (47.000 genes). Las señales de control se restaron. Los resultados representan los datos acumulados de 12 conjuntos diferentes. Los experimentos se realizaron por triplicado (n = 3) para cada línea celular con los controles correspondientes. Las escalas son log2.